王棟，馮杰，張麗敏，詹曉北，鄭志永

(江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

耐鹽米曲霉CICIM F0899在醬油釀造過程中的應(yīng)用*

王棟，馮杰，張麗敏，詹曉北，鄭志永

(江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

耐高鹽環(huán)境的蛋白酶對醬油工業(yè)有著積極作用。該實驗對1株產(chǎn)耐鹽蛋白酶的米曲霉CICIM F0899在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中的作用進行了研究，并同滬釀3042進行了比較。結(jié)果表明，在醬醪發(fā)酵階段，微生物代謝產(chǎn)酸使醬醪pH持續(xù)下降，影響了蛋白酶的活性，導(dǎo)致醬油中氨基態(tài)氮和風味物質(zhì)含量的變化，在180天時氨基態(tài)氮含量達到0.62 g/100 mL，比滬釀3042高11.11%。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)對揮發(fā)性成分進行了分析鑒定，檢測出醬醪中7大類共49種揮發(fā)性化合物，其中酯類、雜環(huán)類化合物的含量明顯高于滬釀3042，而醛類物質(zhì)的含量相對較少。因此，米曲霉CICIM F0899在氨基態(tài)氮含量和風味組成方面都具有更加明顯的優(yōu)勢。

醬醪，蛋白酶，米曲霉，風味成分

醬油是一種傳統(tǒng)的調(diào)味品，起源于我國，迄今已有3000年歷史，在中國、日本、韓國和其他亞洲國家廣受歡迎[1］。我國醬油年產(chǎn)量達500多萬t，占到世界年產(chǎn)量的60%以上，但多為低鹽固態(tài)醬油，隨著生活水平的提高，人們對高品質(zhì)醬油的需求不斷增加。因此，高鹽稀態(tài)醬油將是未來的發(fā)展方向。但是，由于我國對醬油方面的基礎(chǔ)研究水平同國外相比存在一定差距，尤其是在菌種選育方面。日本的醬油產(chǎn)業(yè)目前處于世界領(lǐng)先地位，菌種主要使用的是米曲霉(Aspergillus oryzae)和醬油曲霉(Aspergillus sojae)[2］。滬釀3042是我國目前在醬油工業(yè)中常用的菌種，具有蛋白酶活力高，分生孢子大，數(shù)量多，生長繁殖快，抗雜菌能力強，釀造的醬油風味較好和不產(chǎn)毒素等優(yōu)點，基本可以滿足醬油釀造的需要。

醬油的釀造主要是利用微生物的酶系的作用，對原料中的蛋白質(zhì)和淀粉類物質(zhì)進行降解，生成特有的色、香、味、體的過程。醬油的品質(zhì)主要取決于發(fā)酵菌株和發(fā)酵工藝，其中，優(yōu)良的發(fā)酵菌株對產(chǎn)品的品質(zhì)具有重要的影響。許多學者在菌株的篩選和誘變方面做了大量的工作[3-4］。高鹽稀態(tài)醬油的醬醪發(fā)酵階段由于高鹽和低pH兩種因素，導(dǎo)致米曲霉所產(chǎn)生的蛋白酶活性和穩(wěn)定性都受到影響，因此，尋找可以產(chǎn)生耐受高鹽環(huán)境蛋白酶的米曲霉菌株對醬油產(chǎn)業(yè)具有積極的意義。我們在之前的研究中發(fā)現(xiàn)了1株可以產(chǎn)生耐高鹽蛋白酶的米曲霉菌株，命名為米曲霉CICIM F0899，本文以1株可以產(chǎn)生耐鹽蛋白酶的米曲霉CICIM F0899它為對象，研究了高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中總酸、pH、蛋白酶活力、氨基態(tài)氮、游離氨基酸的變化過程及揮發(fā)性風味物質(zhì)，并同滬釀3042進行了比較。

1 材料與方法

1.1 菌株

米曲霉，保藏于江南大學工業(yè)微生物菌種保藏中心，編號為CICIM F0899(以下簡稱F0899)。

滬釀3042，保藏于生化工程與反應(yīng)器研究室(以下簡稱3042)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化培養(yǎng)

將保存的米曲霉菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中，置30℃培養(yǎng)48 h，活化后備用。

1.2.2 制曲方法

將豆粕、炒麥和拌料水按照1.1∶0.9∶2.0混勻后，經(jīng)過121℃，30 min滅菌處理。以1%(w/w)接種量接入培養(yǎng)好的種曲，控制曲料品溫在30℃，培養(yǎng)48 h，取樣測定大曲蛋白酶酶活。

1.2.3 醬醪發(fā)酵

大曲成熟后，按照1∶3的比例加入23.5%(w/v)鹽水，放置于15℃條件下1個月，然后轉(zhuǎn)移到30℃條件下放置5個月。每個月取樣5 mL醬醪，于10000r/min離心10 min，去除沉淀，上清液放置于4℃冰箱中保存。

1.2.4 蛋白酶活測定方法

采用改進的福林酚法[5］。大曲蛋白酶活力定義為:在40℃，pH 7.2條件下1 min水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位(U)。

1.2.5 pH、氨基態(tài)氮和總酸的測定方法

均按照GB 18186—2000規(guī)定檢測。

1.2.6 游離氨基酸分析方法

采用高效液相色譜法測定。1 mL樣品用10%(w/v)的三氯乙酸定容至50 mL，靜置沉淀2 h，10000 r/min離心10 min，去除沉淀。上清液過0.45 μm濾膜待測。

采用安捷倫HP1100高效液相色譜儀，裝配ZORBAX XDB-C18柱(4.0 mm×125 mm)，配備紫外檢測器，鄰苯二甲醛自動柱前衍生化反應(yīng)。流動相組成:A:20 mmol/L醋酸鈉溶液(pH 7.2);B:醋酸鈉溶液(20 mmol/L，pH 7.2)-甲醇-乙腈(體積比為 1∶2∶2)。梯度洗脫:A∶B 在0～17 min內(nèi)從100∶0～50∶50;在17～20 min內(nèi)從(50∶50)～(0∶100);在 20～24 min保持0∶100。流速:1.0 mL/min。柱溫:40℃。檢測波長:338 nm(脯氨酸在262 nm)。進樣量為20 μL，與標準品對比定性，內(nèi)標法積分定量。

1.2.7 頂空固相微萃取

準確吸取10 mL發(fā)酵180 d的醬醪濾出液置于15 mL頂空瓶中，在磁力攪拌器上50℃加熱平衡15 min，將老化好的85 μm PA萃取頭插入樣品頂空部分，推出纖維頭，于50℃頂空吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250℃解吸3 min。

1.2.8 GC-MS聯(lián)用條件

采用美國瓦里安公司氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀1200L GC/MS-MS。

色譜條件:色譜柱為DB-WAX，30 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管柱;載氣為 He氣;流量0.8 mL/min，不分流進樣。程序升溫:起始溫度40℃，保持4 min，以6℃/min的速率升至160℃，再以10℃/min的速率升至220℃，保持6 min。

質(zhì)譜條件:接口溫度為 250℃;離子源溫度200℃;離子化方式EI;電子能量70 eV;檢測電壓，350 V;發(fā)射電流 200 μA。

實驗數(shù)據(jù)處理由Xcalibur軟件系統(tǒng)完成，未知化合物經(jīng)計算機檢索，同時與NIST譜庫和Wiley質(zhì)譜庫相匹配進行定性，采用峰面積歸一化法進行相對定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬醪發(fā)酵過程中pH值和總酸的變化

總酸通常是檢測發(fā)酵過程的一個重要參數(shù)，它的變化同微生物菌群的代謝情況有密切關(guān)系。在醬醪發(fā)酵的初始階段，由于高鹽環(huán)境的抑制作用，僅有少量的耐鹽微生物可以在其中生長繁殖，其中占優(yōu)勢的主要是乳酸菌。乳酸菌由于沒有其他微生物的競爭抑制，導(dǎo)致了數(shù)量的快速增加，并產(chǎn)生大量的乳酸，因此，導(dǎo)致了醬醪發(fā)酵初期的pH值迅速下降。隨著發(fā)酵過程的繼續(xù)，由于乳酸菌產(chǎn)酸的不斷積累，導(dǎo)致pH值下降到5.0左右，而過低的pH值又抑制了乳酸菌的生長，此時，一些可以耐高鹽和低pH值的酵母開始大量繁殖，并逐漸占優(yōu)勢。

從圖1可以看出，醬醪發(fā)酵前期的總酸迅速增加，F(xiàn)0899醬醪的總酸從0.32%增加到了1.37%，而pH值則從7.02下降到了5.55。隨后總酸的增加變的緩慢，到第6個月，總酸達到了1.82%，而pH值降到了4.83。而3042在發(fā)酵階段總酸含量高于F0899，pH到第6個月下降到了4.66。報道的傳統(tǒng)的中國醬油pH通常在4.05～5.41[6］，印度傳統(tǒng)醬油的 pH 通常在 4.50～5.90[7］。

圖1 pH值和總酸變化過程

2.2 醬醪發(fā)酵過程中蛋白酶活力和氨基態(tài)氮變化

蛋白酶的活力和穩(wěn)定性對醬油的原料利用率和品質(zhì)有著重要的作用。氨基態(tài)氮是衡量醬油品質(zhì)的一個重要指標，它的含量同蛋白酶活力有著密切的關(guān)系。醬醪屬于一種極端的生理環(huán)境，具有高鹽度和低pH的特點。蛋白酶的活力在其中會受到高鹽度的抑制，從而導(dǎo)致發(fā)酵周期的延長，低pH值則會影響到蛋白酶的穩(wěn)定性。可以耐受高鹽環(huán)境的蛋白酶對醬油發(fā)酵具有重要的作用，在我們前期的實驗中對F0899和3042所產(chǎn)的中性蛋白酶性質(zhì)進行了比較，發(fā)現(xiàn)在18%鹽濃度下仍可保留20%的酶活，是3042中性蛋白酶活力的2.2倍[8］。

圖2 蛋白酶活力和氨基態(tài)氮變化過程

從圖2看出，F(xiàn)0899蛋白酶的活力在整個醬醪發(fā)酵階段持續(xù)的下降，在前60 d里，酶活的下降速度稍慢，隨后加速下降，從最初的11769 U/mL降到了1961 U/mL。經(jīng)過180 d的發(fā)酵，酶活剩余16%，而3042的酶活僅能剩余8%。Wilfred研究了傳統(tǒng)印度醬油的醬醪階段常規(guī)理化指標的變化，發(fā)現(xiàn)蛋白酶在醬醪發(fā)酵的前2個月里具有較高的穩(wěn)定性[9］。氨基態(tài)氮的產(chǎn)生則是主要集中在前60天，從最初的0.06 g/100mL增加到了0.46 g/100 mL，并在第6個月達到0.62 g/100 mL，比3042高出了11.11%。氨基態(tài)氮的產(chǎn)生主要集中在發(fā)酵前期，這和許多學者的研究相一致[10-11］，說明和蛋白酶的逐漸失活密切相關(guān)。

2.3 醬醪發(fā)酵過程中游離氨基酸變化

食物的口感主要由低分子量物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)所決定?？谖锻ǔ７譃?種，即甜味、苦味、咸味、酸味和鮮味[12］。醬油中的游離氨基酸主要是由多肽的進一步降解而產(chǎn)生，對醬油口感的形成具有重要的作用。不同的氨基酸可以提供不同的口味，谷氨酸具有強烈的鮮味，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸具有甜味，而纈氨酸、苯丙氨酸和組氨酸具有苦味。

從圖3可以看出，大部分游離氨基酸的含量都隨著發(fā)酵時間而不斷增加，其中，谷氨酸的含量最高，到第6個月時，含量達到7.12 mg/mL，比3042高出了10.56%，占到總游離氨基酸的19.18%，其次是天冬氨酸，含量達到了 10.77%，更是比 3042高出了13.19%。谷氨酸和天冬氨酸都是醬油中的鮮味氨基酸，其含量對醬油的口感有著重要的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)0899所釀造出的醬油在氨基酸組成方面優(yōu)于3042。

圖3 F0899在醬油釀造過程中的游離氨基酸變化

圖43042在醬油釀造過程中的游離氨基酸變化

2.4 醬醪中揮發(fā)性成分分析

醬油的香氣成分主要由醬油中的一些揮發(fā)性風味物質(zhì)組成。雖然在醬油中的含量很少，但是成分卻極為復(fù)雜，是衡量醬油品質(zhì)的一個重要指標。醬醪中的揮發(fā)性成分及相對含量見表1。

從表1中可以看出，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法對F0899發(fā)酵的高鹽稀態(tài)醬油的風味進行了分析，通過譜圖檢索共得到49種揮發(fā)性化合物，包括醇、酸、酯、醛、酮、酚和雜環(huán)化合物共7大類物質(zhì)。共檢出醇類物質(zhì)11種，相對含量為35.98%。而在3042發(fā)酵的醬油中共檢測出揮發(fā)性風味物質(zhì)為40種。醬油中被檢出的1-辛烯-3-醇被報道具有強烈的草藥香韻，近似于薰衣草、玫瑰和干草的香氣，甜草藥似的味道[13］，對醬油風味起著重要的作用，而在3042發(fā)酵的醬油中未檢出。苯乙醇具有玫瑰樣的香氣，氣味比較清淡，呈先苦后甜的桃子樣味道，以游離態(tài)或酯化態(tài)存在于某些天然產(chǎn)物中，對醬油風味也有重要作用。3-甲硫基丙醇在低濃度是具有強烈的肉湯樣香氣[14］，呋喃醇具有特殊的苦辣氣味，各種醇類物質(zhì)相互協(xié)調(diào)，賦予了醬油特殊的風味特征。

表1 醬醪中揮發(fā)性成分分析

酸類物質(zhì)共檢出5種，總含量為33.49%。其中以乙酸為主，含量達到18.15%。醬油中的有機酸具有獨特的香氣，可以豐富醬油的風味背景，對醬油風味起到調(diào)和作用，而且可以同醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，有機酸的酸味可以緩和醬油的咸味，使醬油的口感更加的柔和。

酯類物質(zhì)共檢出7種，總含量為7.58%，以乳酸乙酯為代表。在3042發(fā)酵的醬油中檢出5種，含量僅為4.77%。酯類是構(gòu)成醬油風味成分的主體物質(zhì)，是由有機酸與醇類發(fā)生酯化反應(yīng)而形成的。酯香具有香味清，散逸快、遠、易感覺到的特點，在醬油中起著香甜、濃郁而柔和的基底作用，同時可以增強其他如苯乙醇等化合物的風味。

醛類物質(zhì)共檢出10種，總含量為11.25%，而在3042發(fā)酵的醬油中檢出的醛類物質(zhì)為12種，總含量達到了17.36%。醛類通常具有刺激性氣味，適當含量的醛類物質(zhì)具有調(diào)和香氣的作用，并且能與醇類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成一些列復(fù)雜的風味化合物，使醬油風味更加豐富[14］。但是含量過高也會影響醬油的風味。苯甲醛具有類似于杏仁的芳香氣味，苯乙醛具有類似于風信子、紫丁香樣的香氣，糠醛具有焦香氣味和甜樣焦糖氣味。

酚類物質(zhì)共檢出4種，總含量為6.24%。其中，愈創(chuàng)木酚具有特殊的甜香香氣，微帶酚的氣息，典型的煙熏風味化合物，通常存在于咖啡、酒和干酪中，在二者發(fā)酵的醬油中均被檢出。

雜環(huán)類化合物共檢出5種，以吡嗪類為主。吡嗪類化合物是含有1，4-二氮雜苯母環(huán)的一類化合物的總稱，這類化合物具有強烈的香氣，而且香氣透散性好，極限濃度極低，具有堅果、水果、豌豆、芝麻、花生、胡椒等香味[15］，對醬油的香氣具有較大的貢獻。

3 結(jié)論

通過對1株可以產(chǎn)生耐鹽蛋白酶的米曲霉菌株F0899進行高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵，并對常規(guī)理化指標進行跟蹤，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前期，由于總酸的迅速增加，使醬醪的pH值快速下降，并導(dǎo)致了蛋白酶活力的下降，氨基態(tài)氮的生成主要集中在發(fā)酵初期。

運用高效液相色譜技術(shù)對游離氨基酸進行分析，發(fā)現(xiàn)大部分游離氨基酸的含量都隨著發(fā)酵時間而不斷增加，其中，谷氨酸的含量最高，到第6個月時，含量達到0.71 mg/mL，占到總游離氨基酸的19.18%，其次是天冬氨酸，含量也達到了10.77%。

運用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對所發(fā)酵的醬油進行了揮發(fā)性化合物分析，通過檢索NIST和Wiley質(zhì)譜圖譜共鑒定出醇、酸、酯、醛、酮、酚、雜環(huán)化合物共7類49種化合物。其中，1-辛烯-3-醇、苯乙醇、三甲硫基丙醇、愈創(chuàng)木酚、乳酸乙酯等是醬油中的重要風味物質(zhì)。

通過和滬釀3042進行比較，發(fā)現(xiàn)從蛋白酶在高鹽環(huán)境下的活力、穩(wěn)定性、釀造醬油的氨基酸組成和揮發(fā)性成分等方面，F(xiàn)0899均明顯優(yōu)于3042。

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ABSTRACTHigh salt-tolerant protease has important role in the soy sauce fermentation process.The effect of a high salt-tolerant protease-producing mould Aspergillus oryzae CICIM F0899 on soy sauce fermentation was investigated，and compared with Aspergillus oryzae 3042.Results showed that the organic acids were produced by microorganisms at moromi fermentation stage and caused the pH declination excessively.The organic acids also influenced the protease activity and led to changing of amino nitrogen and volatile compounds.The amino nitrogen content was reached to 0.62 g/100mL，was 11.11%higher than 3042.GC-MS was applied to analyze the flavour compounds of the soy sauce.Totally 49 compounds classified to 7 categories were identified，wherein the content of esters and heterocyclic compounds were higher than those in 3042 and aldehydes were lower.Therefore Aspergillus oryzae CICIM F0899 has more advantage on soy sauce fermentation.

Key wordsmoromi，protease，Aspergillus oryzae，flavor

Application of a Salt-tolerant Aspergillus oryzae CICIM F0899 in Soy Sauce Fermentation

Wang Dong，F(xiàn)eng Jie，Zhang Li-min，Zhan Xiao-bei，Zheng Zhi-yong
(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214000，China)

博士研究生(詹曉北教授為通訊作者)。

*國家“十一五”科技支撐計劃重點項目(No.2008BAI63B06，No.2007BAK36B03)，國家“十二五”科技支撐計劃(No.2011BAD23B04)

2011-12-01，改回日期:2012-04-05