曹茜，汪勇，唐書(shū)澤

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

磷脂酶A1(Lecitase Ultra)大孔樹(shù)脂固定化研究

曹茜，汪勇*，唐書(shū)澤

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632）

選用9種樹(shù)脂對(duì)磷脂酶A1（Lecitase Ultra）進(jìn)行固定化，比較得出最適合的固定化載體為D101型號(hào)的大孔樹(shù)脂。對(duì)其固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了固定化最優(yōu)的條件為：酶液和樹(shù)脂液料比1∶1（mL/g），磷酸鹽緩沖液pH為6.5，室溫下固定化時(shí)間60 min。在此條件下的得到的固定化酶的酶活力為750.0 U/g。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀測(cè)了固定化前后，樹(shù)脂表面特征的變化。

磷脂酶A1；固定化；大孔樹(shù)脂；水解

Abstract:Nine types of macroporous resins were tested for immobilization of phospholipase A1(Lecitase Ultra),and D101 resin was selected as the carrier for this immobilization.The optimal conditions for immobilization of Lecitase Ultra by D101 resin were obtained as follows：ratio of enzyme solution to carrier 1∶1(mL/g)，adsorption time 60 min at ambient temperature,and phosphate buffer pH 6.5.The activity of immobilized Lecitase Ultra under the optimal conditions was 750.0 U/g.scanning electron microscope was introduced to investigate the changes of resin surface before and after the immobilization.

Key words：Phospholipase A1;immbolization;macroporous resin;hydrolysis

磷脂酶A1是一類可以催化水解磷脂Sn-1位酯鍵獲得2-?；?溶血磷脂和脂肪酸的酶，它廣泛存在于動(dòng)植物和微生物組織中[1]。水解得到的溶血磷脂產(chǎn)品在食品、化妝品和藥品行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[2]。價(jià)格低廉的磷脂酶A1在工業(yè)上具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)前磷脂酶A1的相關(guān)研究主要集中在酶法脫膠技術(shù)方面[3-5]。

酶的固定化是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi),使之仍具有特有的催化反應(yīng)功能且能回收重復(fù)使用的一類技術(shù)[6]。和所有游離酶一樣，液體的磷脂酶A1在使用上存在不易回收利用,使用式一次成本相對(duì)較高等問(wèn)題[7]。固定化就可以較好地解決這個(gè)問(wèn)題，將酶固定在高比表面積的載體上,可擴(kuò)大其與底物的接觸面積,有利于底物分子的擴(kuò)散,同時(shí)提高酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性。同時(shí)固定化可以調(diào)節(jié)和控制酶的活性和選擇性,有利于酶在有機(jī)溶劑中的反應(yīng),并可以很方便地從反應(yīng)體系中分離和重復(fù)使用[8]。酶的固定化方法很多，常用的有物理吸附法、共價(jià)偶連法、包埋法和交聯(lián)法[9-14]。相比而言，物理吸附固定化操作簡(jiǎn)單，對(duì)酶的結(jié)構(gòu)影響較小，固定化后酶活力較高。

采用9種大孔樹(shù)脂為載體對(duì)磷脂酶A1進(jìn)行固定化，通過(guò)比較固定化酶水解油脂的效率來(lái)判斷固定化活性，篩選較好的固定化酶的樹(shù)脂，并對(duì)該種樹(shù)脂的固定化條件進(jìn)行優(yōu)化。采用掃描電鏡對(duì)固定化酶進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷脂酶A1（Lecitase Ultra）：丹麥諾維信公司；大豆油：東海糧油工業(yè)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：阿拉丁試劑公司；牛血清蛋白：廣州市齊云生物科技公司；大孔樹(shù)脂，型號(hào)：D113 、D151、D152、D101、Ab-8 、110、CD-180和Dk110：安徽三星樹(shù)脂科技有限公司；Amberlite XAD-2大孔樹(shù)脂：美國(guó)羅門哈斯公司。其它試劑為AR級(jí)，購(gòu)于廣州市東巨化學(xué)試劑有限公司。

W5180P型恒溫浴鍋和攪拌器：廣州華興科儀公司；DT5-4型離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海恒一科技有限公司；S-3700N型電子掃描顯微鏡：德國(guó)布魯克儀器公司；PHS-3E型pH計(jì)：廣州華興科儀公司；DZF6050真空干燥箱：上海恒一科技有限公司；UV9600紫外可見(jiàn)分光光度器：北京瑞利分析儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 載體大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

吸附用大孔樹(shù)脂采用無(wú)水乙醇浸泡24h，再依次用5%的HCl和5%的NaOH溶液浸洗樹(shù)脂并濾干5次~6次，用去離子水洗至中性后最后用pH 6.8磷酸緩沖液（0.02 mol/L）浸泡待用[15-17]。

1.2.2 吸附用大孔樹(shù)脂的選擇

在小燒杯中放入2 g大孔樹(shù)脂吸取2 mL酶液加入10 mL 0.1%的CaCl2溶液，室溫振蕩吸附4 h，上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)酶蛋白的吸附率，方法詳見(jiàn)1.2.4。參照磷脂酶A1催化水解大豆油的方法[18]，測(cè)定固定化酶的酶活性，從中選取合適型號(hào)的樹(shù)脂作為固定化酶載體。催化水解大豆油的具體條件為：大豆油20.0 g、8.0 g 0.1%的氯化鈣溶液、反應(yīng)溫度35℃、反應(yīng)時(shí)間1 h、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min。定義單位時(shí)間（min）水解大豆油，釋放出產(chǎn)物脂肪酸的微摩爾量為一個(gè)酶活力單位，比較各種樹(shù)脂的固定化效果，從中選取較好的固定化載體。

1.2.3 磷脂酶A1（Lecitase Ultra）的固定化優(yōu)化

將磷脂酶A1酶液、pH 6.8磷酸緩沖液（0.02 mol/L）和處理后的大孔樹(shù)脂（抽濾干）按照一定的比例混合，在一定的溫度下回旋振蕩吸附。真空抽濾分離樹(shù)脂和殘留酶液，并用磷酸緩沖液清洗固定化酶多次，將洗凈后的固定化酶于25℃下放在培養(yǎng)皿中真空干燥3 h~4 h，4℃冰箱保存待用。

1.2.4 樹(shù)脂吸附率的計(jì)算

載體樹(shù)脂的蛋白質(zhì)（酶液）吸附量測(cè)定，蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法（考馬斯亮蘭染色法）[19]。樹(shù)脂的蛋白質(zhì)吸附量的公式如下：

樹(shù)脂的蛋白質(zhì)吸附量=（X1·V1-X2·V2）/W1

式中：X1為吸附前每毫升酶液的蛋白質(zhì)含量，mg；X2為吸附后每毫升酶液的蛋白質(zhì)含量，mg；V1為吸附前液體的體積，mL；V2為吸附后液體的體積，mL；W1為加入樹(shù)脂的質(zhì)量，g。

1.2.5 掃描電鏡觀測(cè)表面結(jié)構(gòu)

采用掃描電鏡對(duì)固定化酶和樹(shù)脂表面進(jìn)行觀測(cè)，制備電鏡樣品經(jīng)過(guò)脫水，固定，噴金處理（一般物質(zhì)的二次成像模糊，在表面采用離子濺射鍍膜法可以將樣品表面鍍上金屬離子膜便于觀測(cè)樣品表面形態(tài)）后，再觀測(cè)成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷脂酶蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以9種大孔樹(shù)脂為載體，采用物理吸附法對(duì)磷脂酶A1進(jìn)行固定化，2.0 g樹(shù)脂、2.0 mL酶液（酶蛋白質(zhì)量為12.40 mg/mL），加入10.0 mL的0.1%的CaCl2溶液，室溫振蕩吸附4.0 h，所得結(jié)果如表1所示。

表1 不同樹(shù)脂的物化性質(zhì)以及固定化磷脂酶A1的酶活力和蛋白吸附率Table 1 The physical properties of different resin and phospholipase A1(Lecitase Ultra)enzyme activity of phospholipids and protein adsorption rate

從表1可以看出，大孔樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)吸附率并不與固定化酶的活力成正比，AB-8型樹(shù)脂對(duì)酶蛋白的吸附率最高，為75.75%，但是其固定化酶的活力為331.3 U/g。D101型和Amberlizte XAD-2型這2種樹(shù)脂對(duì)酶蛋白的吸附率非常接近，且固定化酶的酶活力也接近，達(dá)到409.2 U/g和409.5 U/g。固定化酶的酶活力一方面由固定化載體吸附的酶蛋白的量決定，更重要是固定化載體（樹(shù)脂）吸附的酶的空間構(gòu)型以及載體的孔徑以及微環(huán)境對(duì)酶的活力有著更大的影響。D101型和Amberlizte XAD-2在本研究中都可以成功吸附酶，并保持較高的活力?？紤]到國(guó)產(chǎn)的D101型樹(shù)脂在成本上有明顯優(yōu)勢(shì)，所以本研究選用D101型樹(shù)脂作為固定化酶的載體。

2.2 樹(shù)脂D101固定磷脂酶A1(Lecitase Ultra)條件優(yōu)化

2.2.1 酶添加量（液料比）對(duì)固定化效果的影響

D101 型樹(shù)脂（2.0g）分別添加 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL磷脂酶A（1Lecitase Ultra）酶液，加入10.0 mL的0.1%CaCl2溶液，在溫度35℃搖床180 r/min固定3.0 h后抽濾。放入培養(yǎng)皿室溫真空干燥4.0 h，然后用于催化水解大豆油，計(jì)算其酶活力，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶液添加量對(duì)固定化的影響Fig.1 Effect of differernt adding amount of liquid phospholipase A1(Lecitase Ultra)on the activity of phospholipids

從圖1可以看出，在固定化階段隨著液料比的增加，固定化酶的活力也隨之增加。但是當(dāng)液料比超過(guò)1.0 mL/g時(shí)，酶活力增加的趨勢(shì)變緩。在液料比低時(shí)，由于酶蛋白濃度較低，樹(shù)脂沒(méi)有飽和吸附，相應(yīng)的酶活力較低。隨著液料比的提高，樹(shù)脂吸附酶的量逐漸飽和，即使繼續(xù)增加液體酶，樹(shù)脂也無(wú)法吸附更多的有效蛋白，所以出現(xiàn)了再液料比大于1.0 mL/g時(shí)，酶活力增加緩慢的情況。綜合是因?yàn)闃?shù)脂吸附酶液的量達(dá)到了飽和，隨著外界濃度增加會(huì)有稍稍的增大，但是不是效果不是很明顯。

2.2.2 吸附時(shí)間對(duì)固定化效果的影響

分別在小燒杯中加入2.0 g D101樹(shù)脂和2.0 mL酶液和10.0 mL 0.1%CaCl2溶液，在溫度35℃搖床180 r/min 固定 20、40、60、80、100 min 后抽濾。放入培養(yǎng)皿室溫真空干燥4.0 h，進(jìn)行水解大豆油實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，隨著固定化時(shí)間的增加是先增加再保持基本不變，在60 min到達(dá)最佳值，由于大孔樹(shù)脂的吸附量是一定的，隨著時(shí)間的增加酶的吸附量增大，在60.0 min時(shí)大孔樹(shù)脂吸附量達(dá)到飽和，時(shí)間再增加水解效果也不會(huì)明顯變化，因此過(guò)過(guò)長(zhǎng)的吸附時(shí)間不會(huì)增加水解效果。

2.2.3 pH對(duì)固定化效果的影響

在小燒杯中加入2.0 g D101樹(shù)脂和2.0 mL酶液,分別加入 10 mL pH 分別為 5.0、6.5、6.8、7.0、7.3 的磷酸緩沖溶液，在溫度35℃搖床180 r/min，固定60 min后抽濾。放入培養(yǎng)皿室溫真空干燥4.0 h，進(jìn)行水解大豆油實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出固定化酶在pH 5~7.5之間時(shí)，酶活力隨著pH的上升先上升后下降，在pH為6.5時(shí)表現(xiàn)為最大酶活力。緩沖液的pH，對(duì)維持酶的空間構(gòu)象以及保持較高酶活力至關(guān)重要。D101樹(shù)脂固定磷脂酶A1最適pH在中性略偏酸性，在工業(yè)化應(yīng)用時(shí)，可以簡(jiǎn)化為不添加緩沖液，直接催化酯化或者水解反應(yīng)，為該酶的應(yīng)用帶來(lái)便利。磷脂酶A1（Lecitase Ultra）在游離狀態(tài)下最適pH為5.0，而固定化酶最適pH為6.5，證明固定化影響了微環(huán)境，導(dǎo)致最適pH發(fā)生變化[20]。

2.2.4 最佳固定化磷條件下脂酶酶活的測(cè)定及固定化酶的表面

D101 樹(shù)脂（2.0 g）添加酶液 2.0 mL，在 pH 為 6.5的條件固定化60 min。真空抽濾，放入培養(yǎng)皿室溫真空干燥4.0 h。干燥后測(cè)得的固定化酶活為750.0 U/g。

用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)大孔樹(shù)脂（D101）固定化前和固定化后的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的掃描，樣品在掃描前先進(jìn)行噴金處理，用S-3700N型號(hào)的掃描電子顯微鏡獲得掃描圖片（見(jiàn)圖 4），從圖 4（a）和（b）可以清晰的觀測(cè)到，固定化前，樹(shù)脂表面較光滑，放大1000倍時(shí)，可以觀測(cè)到正常的樹(shù)脂紋理。從圖4（c）和（d）中可以觀測(cè)到樹(shù)脂表面吸附了酶蛋白，表面出現(xiàn)了皺折。

圖4 a、b為固定化前，c、d為固定化后分別放大倍數(shù)為120倍和1000倍Fig.4 a,b before immobilized respectively amplification times for 120 times and 1000 times and c,d respectively amplification times for 120 times and 1000 times

3 結(jié)論

比較了9種大孔樹(shù)脂吸附法固定磷脂酶A1（Lecitase Ultra），通過(guò)酶活力和蛋白吸附量選擇D101樹(shù)脂為磷脂酶A1最適合固定化載體。對(duì)固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化條件為：酶液和載體液料比為1∶1（mL/g）、固定化時(shí)間60 min、磷酸鹽緩沖液pH 6.5。在此條件下得到的酶活為750.0 U/g。通過(guò)掃描電鏡可以觀測(cè)到D101樹(shù)脂在吸附后表面的變化。

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Immobilization and Application of Phospholipase A1

CAO Qian,WANG Yong*,TANG Shu-ze
（College of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China）

2011-12-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000793）；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2010AA101505）；粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目（2009A020700003）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009B080701063）

曹茜（1987—）,女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

*通信作者：汪勇（1977—），男（漢），副研究員，博士，從事功能性油脂的教學(xué)與科研。