陳丹丹 楊曉芳 中國食品藥品檢定研究院 （北京 100050）

藍(lán)域染色劑：含0.1%臺(tái)酚藍(lán)，用于白內(nèi)障手術(shù)中前囊的染色，辨別撕囊時(shí)前囊和其下灰色、不著色的晶體組織。作為Ⅲ類醫(yī)療器械管理。作為評(píng)價(jià)醫(yī)用生物材料生物學(xué)安全性指標(biāo)之一的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)，是檢測其是否含有引起機(jī)體發(fā)熱的內(nèi)毒素的方法。細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)利用鱟的變形細(xì)胞與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，來判斷樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素限量是否符合規(guī)定，具有簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。本文依據(jù)《中華人民共和國藥典》2005年版附錄XIE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]的要求，考察藍(lán)域染色劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的可行性。

1. 材料與儀器

1.1 試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）：批號(hào)：0802030，規(guī)格：25ml，生產(chǎn)單位：湛江安度斯生物有限公司。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：批號(hào)：2007-5，規(guī)格：100EU，生產(chǎn)單位：中國藥品生物制品檢定所。

鱟 試 劑：靈 敏 度：0.03EU/ml ， 批 號(hào)：0805082，規(guī)格：0.1ml，生產(chǎn)單位：湛江安度斯生物有限公司。

鱟 試 劑：靈 敏 度：0.03EU/ml， 批 號(hào)：08012221，規(guī)格：0.1ml，生產(chǎn)單位：福州新北生化工業(yè)有限公司。

1.2 樣品

藍(lán)域染色劑：批號(hào)：070507 ，規(guī)格：0.5ml/支，生產(chǎn)單位：德國飛龍公司。

1.3 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱：型號(hào)：DL-101-2RS，生產(chǎn)單位：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司。

恒溫水浴箱：型號(hào)：42 ，生產(chǎn)單位：北京市長風(fēng)儀器儀表公司。

2.方法

2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)所用器材，經(jīng)180℃烘烤3小時(shí)以上除去可能存在的外源內(nèi)毒素。

2.2 鱟試劑靈敏度的復(fù)核

按《中華人民共和國藥典》2005年版附錄XIE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法復(fù)核鱟試劑靈敏度[1,2]，結(jié)果見表1。所用兩個(gè)廠家的鱟試劑靈敏度為0.03 EU/ml，其靈敏度符合規(guī)定，可用于試驗(yàn)。

表1. 靈敏度復(fù)核結(jié)果

表2. 干擾預(yù)試驗(yàn)的測定結(jié)果

2.3 計(jì)算樣品的最大有效稀釋倍數(shù)

參照藍(lán)域染色劑的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，本品限值定為0.5EU/ml。目前市售鱟試劑靈敏度一般在0.5～0.03EU/ml,所以供試品在對(duì)應(yīng)不同靈敏度鱟試劑時(shí)的最大有效稀釋倍數(shù)分別為2倍、4 倍、8倍、16倍。

表3. 干擾試驗(yàn)的結(jié)果

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)

取樣品原液，用BET 水制成2倍、4 倍、8倍、16倍系列稀釋溶液[3]，用此系列稀釋溶液作溶劑，稀釋內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，以制成含細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品2λ濃度的內(nèi)毒素溶液，用兩個(gè)廠家靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)做陽性和陰性對(duì)照（試驗(yàn)結(jié)果見表2）。結(jié)果表明，樣品的低倍稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)有抑制作用，在8倍或16倍稀釋后有可能排除干擾。

表4. 藍(lán)域染色劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

2.5 干擾試驗(yàn)

進(jìn)行試驗(yàn)（試驗(yàn)結(jié)果見表3）。結(jié)果表明，Es均在0.5λ～2.0λ，Et均在 0.5Es～2.0Es，說明樣品 16倍稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用，該產(chǎn)品可以采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法控制其質(zhì)量。

按《中華人民共和國藥典》2005年版附錄XIE進(jìn)行干擾試驗(yàn)[4]，分別用BET水及樣品16倍稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為 0.06、0.03、0.015、0.0075EU/ml的溶液，同時(shí)用BET水和樣品16倍稀釋液各做兩管陰性對(duì)照，用兩個(gè)廠家靈敏度均為0.03EU/ml的鱟試劑

2.6 樣品檢測

取樣品16倍稀釋液，用靈敏度為0.03 EU/ml的鱟試劑按中國藥典進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（結(jié)果見表4）。結(jié)果表明，該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是符合規(guī)定的，即樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml。

3.討論

本文先根據(jù)公式計(jì)算出藍(lán)域染色劑的有效稀釋倍數(shù)，先進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)推測無干擾的稀釋濃度，再由正式的干擾試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，從而減少試驗(yàn)的盲目性，避免浪費(fèi)試劑并且節(jié)省時(shí)間。由于樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法存在抑制性干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)此干擾作用可通過稀釋原液16倍的方法而消除。試驗(yàn)結(jié)果還表明，藍(lán)域染色劑的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml，該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是符合規(guī)定的。該產(chǎn)品可以用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法來控制樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

[1]中國藥典，2005年，二部附錄XIE：85～ 88

[2]張逸，魯雙云，高文娟等.建立可吸收醫(yī)用膜細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的新方法.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34，（18）：3442～3446

[3]馮智敏，江肖明，黃得坤.碳酸氫鹽人工腎透析液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，2（3）：274～278

[4]楊勇.葛根素注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究.安徽衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，4（4）：52～53