陳惠瑜 施騰飛 成 玲 林東紅 羅玲清 胡建達(dá)

(福建省婦幼保健院檢驗(yàn)科，福州350001)

全反式維甲酸(ATRA)用于治療急性早幼粒白血病(APL)和格列衛(wèi)(STI571)用于治療慢性粒白血病標(biāo)記著血液系統(tǒng)惡性腫瘤的分子靶點(diǎn)治療時(shí)代已經(jīng)到來。血液系統(tǒng)惡性腫瘤有很多好的分子靶點(diǎn)，而且許多針對(duì)這些靶點(diǎn)的新藥正在臨床試驗(yàn)當(dāng)中。蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib malate，Sutent，Su11248)是一種新的多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，具有抗腫瘤和抗血管生成的雙重作用。2006年1月FDA批準(zhǔn)本品用于甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate，Ggleevec)治療失敗或不能耐受的胃腸道間質(zhì)瘤患者以及晚期腎細(xì)胞癌患者［1，2］，對(duì)其他實(shí)體瘤的治療應(yīng)用也已進(jìn)入Ⅱ期臨床階段，但其與惡性血液病關(guān)系的研究尚不多。國(guó)外有實(shí)驗(yàn)初步表明用SU11248可以誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞樣白血病病人部分緩解［3］，因此，本實(shí)驗(yàn)擬以人髓系白血病細(xì)胞株HL-60為白血病模型，分析SU11248對(duì)白血病細(xì)胞HL-60的作用及可能機(jī)制，以期為白血病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人髓系白血病細(xì)胞株HL-60由福建省血液病研究所傳代保存;SU11248購(gòu)自biocompound公司，用二甲亞砜溶解，-20℃避光保存?zhèn)溆?RPMI1640培養(yǎng)液為 Gibco公司產(chǎn)品;二甲亞砜 、MTT溶液為Sigma公司產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品;AnnexinV Detection Kit為BD公司產(chǎn)品;凋亡周期檢測(cè)試劑盒為北京天來生物醫(yī)學(xué)科技有限公司產(chǎn)品;HaltTMProtease Inhibitor、Protein Extraction Reagent為 Pierce 公司;bcl-2、bax、caspase-3單克隆抗體 (鼠抗人)、Western blot Luminol Reagent:sc-2048為Santa Cruz公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG、硝酸纖維膜(NC膜)均由北京中山生物技術(shù)公司提供。

1.2 方法

1.2.1 建立細(xì)胞培養(yǎng)體系 HL-60細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2天傳代1次，培養(yǎng)中的細(xì)胞密度均保持在(1.0～5.0)×105ml-1，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將其濃度調(diào)整為1.0× 105ml-1，分別與終濃度為 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/ml的 SU11248 共培養(yǎng)，以未處理的HL-60細(xì)胞為對(duì)照，分別接種于96孔板，每孔200 μl，每組設(shè) 4 個(gè)平行孔，置 37℃、5%CO2飽和濕度條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分別于24、48、72、96小時(shí)加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后離心去上清，加入終止液DMSO溶液150 μl/孔，振蕩10分鐘，在酶標(biāo)儀上用雙波長(zhǎng)492 nm和630 nm測(cè)定吸光值(OD值)。計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-用藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集對(duì)照組和 0.25、2.0、4.0 μg/ml SU11248作用48小時(shí) 后的HL-60細(xì)胞，1/15 mol/L PBS洗滌2次。使用1×binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105ml-1。吸取100 μl細(xì)胞到 1.5 ml EP 管，加入 5 μl AnnexinV-FITC 和 5 μl PI。室溫下(20℃ ～25℃)避光輕搖孵育15分鐘后，再加入400 μl 1×binding buffer。1小時(shí)內(nèi)避光送流式細(xì)胞室檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 DNA倍體分析及細(xì)胞周期分析 收集對(duì)照組和2.0 μg/ml SU11248 作用 24、48、72 小時(shí)后的HL-60細(xì)胞，用 1/15mol/L PBS洗滌細(xì)胞 1次(2 000 r/min離心，5分鐘)收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，用70%乙醇固定后PBS洗去固定液，加入200 μl RNase A 37℃水浴30分鐘，再加入800 μl PI染色混勻，4℃避光30分鐘，冰浴，避光送流式細(xì)胞室檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞DNA片段化檢測(cè) 收集對(duì)照組和0.25、2.0、4.0 μg/ml SU11248 作用 48 小時(shí) 后的HL-60細(xì)胞，1/15 mol/L PBS洗滌細(xì)胞2次，加入50 μl細(xì)胞裂解緩沖液(Tris-HCl 10 mmol/L，pH7.6;NaCl 100 mmol/L;EDTA 10 mmol/L)，作用16秒，6 600 r/min，離心5分鐘，吸上清于 EP管。加入SDS，調(diào)整終濃度為1%，加入RNase A，調(diào)整終濃度為1 μg/μl，56℃水溶 2 小時(shí)。加入蛋白酶 K，調(diào)整終濃度 為2.5 μg/μl，37℃水浴 2小時(shí)。加入1/10體積10 mmol/L乙酰胺和2.5體積無水乙醇沉淀DNA，-20℃過夜。12 000 r/min離心5分鐘去上清，沉淀吹干后溶于TE溶液。提取的DNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含0.1%EB)電泳，35 V，3小時(shí)，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.6 Western blot檢測(cè) bcl-2、bax、caspase-3 蛋白水平的變化 以IC50(2.0 μg/ml)的SU11248作用HL-60細(xì)胞后，于24、48、72小時(shí)分別提取蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，簡(jiǎn)述如下:

收集對(duì)照組和2.0 μg/ml SU11248 作用24、48、72小時(shí)后的HL-60細(xì)胞，每組約5×106ml-1個(gè)，離心棄上清，沉淀用1/15 mol/L PBS洗滌2次，去上清(洗滌液要吸干凈)。按1×106細(xì)胞/100 μl裂解液+1 μl蛋白酶抑制劑的比例裂解細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白。Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法)，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

20 μg總蛋白進(jìn)行120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉1小時(shí)。根據(jù)蛋白Marker將膜在適當(dāng)位置剪開，做好標(biāo)記，分別與相應(yīng)的一抗(bcl-2鼠抗人抗體，bax鼠抗人抗體，caspase-3鼠抗人抗體)反應(yīng)過夜。再與相應(yīng)二抗(1∶2 000羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG)室溫下反應(yīng)，ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑放射自顯影，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像掃描分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行掃描分析，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的灰度值之比作為目的條帶蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間比較用 t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制作用量效關(guān)系 不同濃度SU11248作用HL-60細(xì)胞48小時(shí)后，各實(shí)驗(yàn)組SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞均有抑制作用，細(xì)胞增殖反應(yīng)(OD值)與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，并隨藥物濃度的增加抑制率顯著增高(見表1)。

2.1.2 SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制作用時(shí)效關(guān)系 2.00 μg/ml SU11248作用 HL-60細(xì)胞 24、48、72、96小時(shí)后，細(xì)胞增殖反應(yīng)(OD值)均較對(duì)照組明顯降低，P＜0.05(見表2)，在72小時(shí)抑制率達(dá)到最高。

2.2 AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡影響 對(duì)照組、0.25、2.00、4.00 μg/ml SU11248作用HL-60細(xì)胞48小時(shí)后凋亡率分別為1.30%、4.80%、40.89%、43.71%，藥物組較對(duì)照組明顯增高(P＜0.05)且隨藥物作用濃度的增高凋亡率增高(見圖1)。2.3 SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞DNA倍體影響 2.00 μg/ml SU11248作用于HL-60細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組(29.51%)高(P＜0.05)，且隨時(shí)間增加而明顯增加，24、48、72小時(shí)G0/G1期細(xì)胞比例分別為47.91%、54.15%、62.41%，而G2期及S期細(xì)胞比例均下降，而且在各處理組均可見亞二倍體G1峰(凋亡峰)，如圖2A～D所示。與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)。

表1 不同濃度SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Tab．1 Effects of SU11248 with different concentration on cell growth of HL-60 cells

表2 SU11248(2．0 μg/ml)對(duì)HL-60細(xì)胞在不同時(shí)間生長(zhǎng)的影響Tab．2 Effects of SU11248 on cell growth of HL-60 cells at different time points

圖1 AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度SU11248作用HL-60細(xì)胞凋亡率(48小時(shí))Fig．1 Effect of SU11248 on the rate of apoptosis of HL-60 cells detected by flow cytometer with AnnexinV/PI double-stain(48 h)

圖2 DNA倍體分析檢測(cè)SU11248作用HL-60細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞凋亡率Fig．2 Effect of SU11248 on apopotosis induction in HL-60 cells at different time points with analyzing DNA ploidy

表3 SU11248作用HL-60細(xì)胞后bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平的變化(與內(nèi)參β-actin蛋白的比值)Tab．3 Expression of bcl-2，bax，caspase-3 protein of HL-60 cells treated with 2．0 μg/ml SU11248 at different time points(compared with β-actin)

圖3 不同濃度SU11248作用HL-60細(xì)胞48小時(shí)后DNA Ladder凝膠電泳圖Fig．3 Effect of SU11248 on DNA fragmentation in HL-60 cells with different concentration

圖4 Western blot檢測(cè)2．0 μg/ml SU11248 作用 HL-60 細(xì)胞后不同時(shí)間 β-actin、bcl-2、bax、caspase-3蛋白的表達(dá)情況Fig．4 Expression of β-actin，bcl-2，bax，caspase-3 protein in HL-60 cells treated with 2．0 μg/ml SU11248 at different time points

2.4 SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞DNA片段化形成影響瓊脂糖凝膠電泳顯示SU11248作用HL-60細(xì)胞48小時(shí)后，2.0和4.0 μg/ml處理組出現(xiàn)明顯凋亡特征的DNA改變，即呈典型的DNA降解“梯狀”條帶片段，而在0.25 μg/ml處理組沒有出現(xiàn)明顯的梯帶(Ladder)，對(duì)照組細(xì)胞基因組DNA完整，見圖3。

2.5 Western blot檢測(cè)SU11248干預(yù)HL-60細(xì)胞前后bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平變化 2.0 μg/ml SU11248作用24、48、72 小時(shí)后，ECL 熒光顯色實(shí)驗(yàn)中采用β-actin蛋白為內(nèi)參照以保持蛋白上樣量的一致性。Western blot結(jié)果顯示SU11248作用后bcl-2蛋白水平較對(duì)照組低，且隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)逐漸減弱(P＜0.05)，而SU11248作用后caspase-3蛋白水平較對(duì)照組升高，隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P＜0.05)，bax蛋白水平則不發(fā)生明顯變化(P＞0.05)，見表3及圖4。

3 討論

SU11248是一種口服的小分子藥物，能夠抑制VEGF-R2、-R3和-R1以及血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGFR-β)、KIT、FLT-3 和 RET 的酪氨酸激酶活性，通過特異性阻斷這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)［4，5］。SU11248的抗腫瘤活性已經(jīng)在各種晚期惡性腫瘤患者中得到證實(shí)，包括腎細(xì)胞癌、肉瘤、乳腺癌等［6-9］。由于近年來在治療對(duì)格列衛(wèi)無效的腸胃道腫瘤方面顯示了較好的臨床療效，SU11248更加受到了人們的關(guān)注，在實(shí)體瘤方面已有較多的研究，并取得一定的臨床效果，但在國(guó)內(nèi)外，有關(guān)其抗白血病方面的研究鮮見報(bào)道，國(guó)外有初步實(shí)驗(yàn)表明，SU11248可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡從而使急性髓細(xì)胞樣白血病病人部分緩解［3］。本實(shí)驗(yàn)首先通過MTT比色法觀察正常狀態(tài)下HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)以及不同濃度SU11248(0.25～8.0 μg/ml)作用HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖的改變。研究結(jié)果顯示:SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞株具有較強(qiáng)的抑制增殖作用，而且這種抑制作用呈明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。HL-60細(xì)胞與不同濃度SU11248共育時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，IC50約為2.0 μg/ml。DNA有規(guī)律地在核小體之間降解形成梯狀帶，是凋亡細(xì)胞的重要生化標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳顯示，SU11248能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞出現(xiàn)典型的DNA梯狀帶。AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HL-60細(xì)胞凋亡表明SU11248作用的劑量依賴性，隨著作用濃度的升高HL-60細(xì)胞凋亡率也隨之增加。DNA倍體分析表明SU11248可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞出現(xiàn)典型的亞二倍體峰(凋亡峰)，并且存在明顯的時(shí)效關(guān)系。本研究結(jié)果還顯示SU11248具有細(xì)胞周期阻滯作用，可將HL-60細(xì)胞阻滯于G0/G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期。G1期阻滯是細(xì)胞增殖抑制的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞不能進(jìn)入S期，DNA合成無法完成，干擾了蛋白質(zhì)代謝，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的分裂。以上實(shí)驗(yàn)表明，SU11248在體外能抑制HL-60細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量的依賴性。

為探討SU11248對(duì)白血病細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡作用的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測(cè)SU11248干預(yù)HL-60細(xì)胞前后凋亡信號(hào)通路分子bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平的變化。

研究結(jié)果顯示在SU11248抑制HL-60細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中bcl-2基因較對(duì)照組低且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下調(diào)，bax基因無明顯變化。提示SU11248可能是通過調(diào)節(jié)bcl-2家族蛋白中bcl-2蛋白的表達(dá)改變抗凋亡分子和促凋亡分子之間的比率最終實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)被認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡的執(zhí)行階段，且該反應(yīng)可被抗凋亡bcl-2家族蛋白分子所拮抗［10］。在探討了SU11248對(duì)白血病細(xì)胞HL-60中bcl-2家族蛋白bcl-2的調(diào)節(jié)作用后，本研究進(jìn)一步考察了SU11248對(duì)HL-60細(xì)胞中caspase-3的影響。Western blot結(jié)果表明，SU11248可以通過促進(jìn)caspase-3的裂解而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)HL-60細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

上述研究結(jié)果提示:SU11248作用于人白血病細(xì)胞后可以通過誘導(dǎo)bcl-2家族蛋白的改變而促發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C，隨后通過裂解caspase-3而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終完成了對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用?？傊{(diào)節(jié)bcl-2家族蛋白之間的平衡并激發(fā)caspase級(jí)聯(lián)途徑從而通過內(nèi)部途徑促進(jìn)凋亡是SU11248在體外發(fā)揮抑制人白血病細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制之一。SU11248是否同時(shí)還可通過其他凋亡調(diào)控途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)及其相應(yīng)的確切機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。

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