龍方懿 印國兵 劉智敏 楊俊艷 賈朝莉 劉小花 董超然 王 旎

(重慶醫(yī)科大學分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，重慶400016)

乳腺癌在全球范圍內(nèi)一直位居女性惡性腫瘤的首位，且呈逐年上升趨勢，大大危害著女性健康，乳腺癌的發(fā)展受多因素的調(diào)控。

在腫瘤細胞增殖過程中，缺氧是實質(zhì)性腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一［1］，細胞對缺氧的反應主要是由低氧誘導因子1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)來調(diào)節(jié)的。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基構(gòu)成，HIF-1β組成性表達，而HIF-1α作為氧調(diào)節(jié)亞基，決定著HIF-1的活性，HIF-1α的過表達與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2］。金屬硫蛋白(Metallothioneins，MTs)是一類低分子量高半胱氨酸含量的非酶金屬結(jié)合蛋白質(zhì)家族，在細胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用。鈣黏蛋白E(E-cadherin)是鈣依賴性介導細胞間連接的黏附分子，其表達的下調(diào)或喪失是大多數(shù)腫瘤細胞的特征之一，而Slug作為Snail鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可通過與E-cadherin啟動子的E-box結(jié)合，下調(diào)E-cadherin的表達進而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［3］。

目前，有關(guān) HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在乳腺癌中的表達及其相關(guān)性研究報道甚少，本研究通過采用免疫組化SP法與RT-PCR檢測乳腺癌中HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在蛋白水平和mRNA水平的表達情況，進而探討HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin能否作為監(jiān)測乳腺癌發(fā)展的指標。

1 材料與方法

1．1 材料 69例2009年2月～2010年10月手術(shù)后經(jīng)病理診斷為乳腺癌的組織標本來自于重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院普外科。按WHO乳腺腫瘤組織學類型分類標準:浸潤性導管癌48例，浸潤性小葉癌21例。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)乳腺癌TNM分期標準(2003):Ⅰ期3例，Ⅱ期48例，Ⅲ期18例，Ⅳ期0例。所有患者均是女性，年齡26～79歲，中位年齡49歲，全部患者術(shù)前未接受放療、化療及激素治療。人乳腺癌細胞系MCF-7與MDA-MB-231均來自于本實驗室。

1．2 主要試劑 鼠抗人Slug單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品;鼠抗人MT單克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品;兔抗人HIF-1α多克隆抗體為Millipore公司產(chǎn)品;兔抗人E-cadherin多克隆抗體、DAB試劑盒和免疫組化SP法試劑盒均購于北京中杉金橋公司;總RNA提取RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、Premix Taq DNA酶購自TaKaRa公司;RT-PCR引物由TaKaRa公司合成。

1．3 實驗方法

1．3．1 免疫組化SP法 采用鏈霉親和素-過氧化物酶法(SP法)。標本均經(jīng)過10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，切片分別作免疫組化染色和HE染色，免疫組化SP法及DAB顯色操作步驟均按照說明書進行。用已知陽性切片作陽性對照，用PBS替代一抗作陰性對照。

1．3．2 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌 MCF-7與 MDA-MB-231細胞貼壁培養(yǎng)于含10%新生小牛血清(四季青公司)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)中，置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1．3．3 細胞總 RNA 提取 按照 RNAiso Plus(TaKaRa公司)試劑說明書要求操作，分別提取人乳腺癌MCF-7與MDA-MB-231細胞總RNA，所提取的總RNA用紫外分光光度計(Bio-Rad)定量并檢測其純度，純度為OD260/OD280≥1．8的總RNA提取物用于后續(xù)試驗。

1．3．4 RT-PCR PCR 引物序列見表1，RT-PCR 反應按說明書進行，反應產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳并拍照，以DL1000 DNA Maker(TaKaRa公司)為參照，采用Quantity One軟件對RT-PCR檢測結(jié)果進行圖像分析。

1．4 結(jié)果判定 免疫組化實驗結(jié)果采用半定量法進行判定:光鏡下每張切片選取5個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)100個細胞，胞核、胞漿或胞膜染色為棕黃色或深棕黃色的細胞為陽性細胞，計算每張切片5個高倍視野中陽性細胞的平均百分率，陽性細胞平均百分率＜10%為陰性表達病例，陽性細胞平均百分率≥10%為陽性表達病例。

PCR反應產(chǎn)物進行電泳后用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)掃描各電泳條帶的平均光密度值并測量其面積，獲得幾何平均光密度。基因表達用相對光密度表示:檢測基因光密度/管家基因光密度。

表1 目的基因HIF-1α、MT、Slug及E-cadherin和內(nèi)參基因GAPDH的PCR引物序列及產(chǎn)物長度Tab．1 The primer sequences and product length of target genes HIF-1α，MT，Slug，E-cadherin and internal control gene GAPDH

1．5 統(tǒng)計學分析 計量資料以x±s表示，應用SPSS18．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。采用χ2檢驗、Spearman等級相關(guān)分析和獨立樣本t檢驗，P＜0．05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在人乳腺癌組織中的表達 在69例乳腺癌組織中，HIF-1α陽性表達率為71．01%(49/69)，在胞漿和胞核均有表達(如圖1E);MT的陽性表達率為 42．03%(29/69)，在胞漿和胞核內(nèi)都有表達(如圖1F);Slug陽性率為43．48%(30/69)，其陽性表達定位于胞漿和胞核(如圖1G);E-cadherin陽性表達率為50．72%(35/69)，主要在細胞膜上表達(如圖1H)。

由表2可知，HIF-1α、Slug和 E-cadherin的陽性表達對于TNM分期和腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著性差異(P＜0．05)，而對于年齡、腫瘤大小及病理類型(浸潤性導管癌或浸潤性小葉癌)，均無顯著性差異(P＞0．05)。MT的陽性表達對于TNM分期具有顯著性差異(P＜0．05)，而對于年齡、腫瘤大小、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型(浸潤性導管癌或浸潤性小葉癌)均無顯著性差異(P＞0．05)。

圖1 乳腺癌組織標本中HIF-1α、MT、Slug和E-cadherin的表達(SP法，×400)Fig．1 The expression of HIF-1α，MT，Slug and E-cadherin in breast cancer tissue(SP method，×400)

表2 HIF-1α、MT、Slug和E-cadherin在乳腺癌中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系Tab．2 Expression of HIF-1α，MT，Slug and E-cadherin in breast cancer and its relationship with clinical pathological characteristics of breast caner

2．2 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在人乳腺癌組織中表達的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，在69例乳腺癌組織標本中，HIF-1α與MT蛋白的表達呈顯著正相關(guān)(r=0．285，P ＜0．05)，MT 與 Slug的表達呈顯著正相關(guān)(r=0．379，P ＜0．01)，Slug和 E-cadherin的表達呈顯著負相關(guān)(r=－0．422，P＜0．01)，見表3。

2．3 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在人乳腺癌細胞系MCF-7與MDA-MB-231中的表達 提取MCF-7與MDA-MB-231細胞總RNA，RT-PCR方法分析在 MCF-7與 MDA-MB-231細胞中 HIF-1α、MT、Slug及E-cadherin mRNA的相對表達水平。PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，在MCF-7與MDA-MB-231細胞中都存在 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin mRNA 的表達，HIF-1α、MT、Slug mRNA 在惡性程度更高的MDA-MB-231細胞中表達高于 MCF-7細胞(P＜0.01)，而E-cadherin mRNA在MDA-MB-231細胞中的表達低于MCF-7細胞(P＜0．01)，如圖2。

表3 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在人乳腺癌組織中表達的相關(guān)性Tab．3 Correlation between HIF-1α，MT，Slug andE-cadherin expression in breast cancer tissues

圖2 HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin RT-PCR 產(chǎn)物凝膠電泳條帶圖及RT-PCR半定量表達的比較Fig．2 RT-PCR product gel electrophoresis and semi-quantitative expression of HIF-1α，MT，Slug and E-cadherin

3 討論

在實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，由于腫瘤的快速生長，腫瘤新生血管供血不足導致局部缺氧，從而誘導HIF-1α表達，被上調(diào)的HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)多種下游基因，進而增強腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，以逃避或適應相對低氧的環(huán)境。HIF-1α在一系列人類腫瘤中表達上調(diào)，并且在一些癌前病變組織中HIF-1α也被檢測到存在，提示HIF-1α的表達可能是腫瘤進展中的早期事件。一般認為在正常組織中鋅、銅和鎘等金屬離子及一些內(nèi)源性因子能夠誘導MT的合成，但在癌細胞中MT合成的機制尚不清楚，有文獻報道在癌組織中HIF-1α能上調(diào)MT的表達，MT的生物學功能不僅在于重金屬解毒，在調(diào)控癌細胞生長和增殖方面也有重要作用，MT可能是腫瘤進展性生物學行為的一個標志物。近年來轉(zhuǎn)錄因子Slug在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用越來越受到人們的關(guān)注，在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤中存在明顯上調(diào)［4-6］。一方面，低氧激活HIF-1α可以上調(diào) Slug的表達;另一方面，Slug可以下調(diào)E-cadherin的表達。E-cadherin是一種重要的阻止腫瘤細胞脫離原發(fā)灶的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，人E-cadherin啟動子E-box含有5'-CACCTG序列，為含helix-loop-helix(HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)合位點，Slug能與此結(jié)合位點結(jié)合，進而下調(diào)E-cadherin的表達，促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［3］。

在本研究的69例乳腺癌組織中，HIF-1α的表達與TNM分期及腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明乳腺癌組織TNM分期越高，組織細胞內(nèi)缺氧越嚴重，且乳腺癌組織中HIF-1α的表達可能有利于癌轉(zhuǎn)移。Spearman等級相關(guān)分析顯示，HIF-1α與MT的表達呈顯著正相關(guān)，說明HIF-1α與MT可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，MT蛋白在多種實體腫瘤及其黑色素瘤和急性淋巴白血病中表達增加，有研究顯示，低氧可誘導前列腺癌細胞表達MT，促進細胞增生，siRNAMT可抑制低氧誘導的細胞增生并誘導凋亡［7］;HIF-1是低氧誘導鼠表達MT所必需的［8］。這些研究表明腫瘤組織MT過表達與低氧激活HIF-1有關(guān)，HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)MT的表達。另一方面，近期研究顯示MT可增加HIF-1α的穩(wěn)定性，進而增強 HIF-1 的轉(zhuǎn)錄活性［9，10］，兩者表現(xiàn)出相互促進作用。在本次研究中，隨著TNM分期的增高MT表達增加，表明MT的表達可能有利于乳腺癌的發(fā)展。通過對MT及Slug相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)它們在乳腺癌組織中的表達呈顯著正相關(guān)，有研究顯示，MT可與細胞內(nèi)多種含鋅蛋白和轉(zhuǎn)錄因子在空間上直接相互作用，提供鋅離子調(diào)節(jié)含鋅蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的活性［11］，Slug也是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，最初在背部神經(jīng)管中被發(fā)現(xiàn)，參與神經(jīng)胚的形成與神經(jīng)干的正常發(fā)育［3］，后來發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中低氧能使Slug表達上調(diào)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。我們推測低氧誘導產(chǎn)生的MT可能與Slug有直接相互作用，提供鋅離子調(diào)節(jié)Slug轉(zhuǎn)錄活性。在本研究中我們還發(fā)現(xiàn)Slug與E-cadherin的表達具有顯著的負相關(guān)。Uchikado等［13］在研究彌散性胃癌和食管鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)Slug的表達與E-cadherin下調(diào)相關(guān)，這與本次研究結(jié)果一致。Slug含有可與E-cadherin啟動子E-box基序結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，作為轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合到E-cadherin啟動子上抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄，Slug的表達上調(diào)與上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而E-cadherin在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有抗轉(zhuǎn)移功能，癌細胞可以通過多種機制抑制E-cadherin的表達，使癌細胞易于脫離原發(fā)灶發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，在間質(zhì)樣浸潤性癌和浸潤性乳腺癌等侵襲性腫瘤中，E-cadherin表達下調(diào)有利于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［14，15］。在本研究中的69例乳腺癌組織中，Slug與E-cadherin的表達均與TNM分期和腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，表明Slug與E-cadherin表達可能有利于乳腺癌發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移。通過RT-PCR 發(fā)現(xiàn)，HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin 在乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞中均有表達，且在惡性程度更高的MDA-MB-231細胞中，HIF-1α、MT、Slug mRNA表達更高，E-cadherin mRNA表達更低，差異具有顯著性(P ＜0．05)。表明 HIF-1α、MT、Slug及E-cadherin的表達情況與乳腺癌的發(fā)展有一定關(guān)系，HIF-1α、MT、Slug的高表達與 E-cadherin的低表達有利于腫瘤惡性程度的增加，這與免疫組化的結(jié)果一致。

通過本次研究及相關(guān)文獻，我們推測:在乳腺癌中腫瘤低氧微環(huán)境可以激活HIF-1。一方面，HIF-1可以上調(diào)MT的表達;另一方面，MT可以增加HIF-1α的穩(wěn)定性，進而增強HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。被上調(diào)的MT可能與Slug有空間上的直接相互作用，提供鋅離子給Slug并增強其活性，Slug作為轉(zhuǎn)錄抑制因子與E-cadherin啟動子的E-box結(jié)合，下調(diào)E-cadherin的表達，進而增強腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，但具體的分子機制還有待于進一步研究。由于HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在乳腺癌中的表達相關(guān)性及其與臨床病理特征的密切關(guān)系，可初步認為HIF-1α、MT、Slug及 E-cadherin在乳腺癌中的表達情況可以作為監(jiān)測乳腺癌發(fā)展的指標。

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