郇延軍，趙亞娟，趙 杰

(1. 江南大學食品學院，江蘇無錫214122;2.南通壽星食品有限公司，江蘇南通226531)

芹菜粉對天然中式香腸顏色影響及工藝優(yōu)化的研究

郇延軍1，趙亞娟1，趙 杰2

(1. 江南大學食品學院，江蘇無錫214122;2.南通壽星食品有限公司，江蘇南通226531)

天然中式發(fā)酵香腸是不添加人造著色成分、化學防腐劑或任何其他人造或合成成分的一種產品。本文以芹菜粉、產硝酸還原酶的木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌作為天然配料，以中式香腸的紅度值a和亞硝酸鹽殘留量為指標，通過單因素實驗確定了四因素(接種量、菌種配比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間)的優(yōu)工藝參數(shù)的基礎上，采用正交實驗L9(34)的方法，確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝參數(shù)條件為:A1B3C2D2，即發(fā)酵時間為30h，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵菌株接種量為107cfu/g，發(fā)酵菌種配比采用木糖葡萄球菌∶肉糖葡萄球菌=1∶2。

發(fā)酵香腸，芹菜粉，天然，有機，木糖葡萄球菌，肉糖葡萄球菌

Abstract:Natural Chinese fermented sausages did not contain any artificial flavor or flavoring，coloring ingredient，or chemical preservative，or any other artificial or synthetic ingredient.The article studied that celery powder，Staphylococcus xylosus and Staphylococcus carnosus were applied to fermented sausages as natural ingredients.Considered products’objective color a(redness)and residual nitrite as the criterion.Through single factor experiment to get better process conditions:temperature of fermentation(A)，time of fermentation(B)，inoculating amount(C)and mixture of bacteria(D).And then the orthorgonal experiment was carried on to confirm best technology parameters of four factors as:A1B3C2D2，namely the strains were time of fermentation was 30h，temperature of fermentation was 30℃，inoculation amount was 107cfu/g，Staphylococcus xylosus∶Staphylococcus carnosus=1∶2.

Key words:fermentedsausages;celery powder;natural;organic;Staphylococcus xylosus;Staphylococcus carnosus

2005年，美國農業(yè)部提出了“天然食品”概念，即不包含任何人造香精、香料、著色成分、化學防腐劑或任何其他人造或合成成分的食品。這類產品的生產中，所有配料必須是天然的［1］。隨著天然食品、有機食品定義的提出，天然肉制品在美國天然食品市場所占的比例也越來越大。2005年，天然肉制品的銷量上升了50%以上，目前，標有天然肉制品的產品已在市場上普遍存在［2］。在有關肉制品的天然配料的研究中，亞硝酸鹽的天然替代物是當前關注的重點之一。亞硝酸鹽和硝酸鹽加入到肉制品中，主要是為了在肉制品加工過程中特別是在腌肉過程中來提高肉制品的風味和色澤，抑制油脂氧化和微生物繁殖［3］。亞硝酸鹽對肉制品色澤的影響尤為重要，如果不添加，那么許多肉制品在感官品質上就會差很多。Sebranek和Bacus介紹了一種天然肉制品的加工方法。這種加工方法主要是利用一些硝酸鹽類物質含量較高的天然食品配料與能產硝酸鹽還原酶的微生物相互配合，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。許多蔬菜含有較多的硝酸鹽，經(jīng)過特殊加工制成高硝酸鹽含量的蔬菜濃縮汁或者蔬菜粉，利用能還原硝酸鹽的微生物的作用，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，從而達到亞硝酸鹽腌制品所擁有的典型色澤。目前研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵肉制品中的木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、肉糖葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)和一些微球菌，是主要的產硝酸鹽還原酶的微生物［1，4-5］。王永霞［6］、于長青［7］、Casaburi［8］等人對木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌具有硝酸還原酶活性進行了驗證。而作為替代硝酸鹽和亞硝酸鹽天然配料的研究，目前主要集中在使用芹菜和蘭花菜等富含硝酸鹽蔬菜上。Sebranek、Bacus［1］對應用芹菜粉和肉糖葡萄球菌進行肉制品加工做了簡要介紹;Sindelar［2］等在牛肉干加工過程也應用了富含硝酸鹽的蔬菜。本文研究了木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生長特性，通過利用木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的發(fā)酵作用和其所具有的硝酸鹽還原酶的特性，探索發(fā)酵香腸的一種發(fā)酵工藝，即以添加富含硝酸鹽的芹菜粉作為天然配料替代傳統(tǒng)工藝添加的亞硝酸鹽。將芹菜粉中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，以達到良好發(fā)色效果和降低亞硝酸鹽殘留量的目的，避免了亞硝酸鹽局部含量過高，從而為天然植物配料在肉制品生產中的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylose，S.xylosus)、肉糖葡萄球菌(Staphylococcus carnosus，S.carnosus)均購于廣東省微生物菌種保藏中心(GIMCC);豬后腿精肉 大潤發(fā)超市;芹菜粉 Florida Food Products，INC，測得亞硝酸鹽含量約為28000mg/kg;天然豬腸衣、玉米淀粉、食鹽、白砂糖、亞硝酸鈉、香辛料等 都符合各自產品要求，市購。

梅特勒-托利多(FE20)pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2600型紫外-可見光分光光度計 天美(上海)儀器有限公司;101-2型干燥箱 上海實驗儀器廠;SPX型智能生化培養(yǎng)箱南京實驗儀器廠;FW-80型高速萬能粉碎機 西安明克斯檢測設備有限公司;C-710型手動灌腸機意大利IaMinerva;AR2140電子精密天平，高壓滅菌鍋，超凈工作臺。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵香腸配方 原料肉:瘦肉70%，肥肉30%;輔料(占肉重的百分比):蔗糖1%，鹽2%，淀粉2%，白胡椒粉0.5%，五香粉0.5%;實驗組加入0.2%芹菜粉(硝酸鹽含量為28000mg/kg)及發(fā)酵菌株，不添加亞硝酸鹽;對照組添加150mg/kg亞硝酸鈉，不添加發(fā)酵菌株。

1.2.2 發(fā)酵香腸的工藝流程

1.2.3 菌株生長曲線測定［9-10］將肉糖葡萄球菌和木糖葡萄球菌在營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)活化后，轉接于空白新鮮液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，用分光光度計在可見光600nm處，每隔2h測定其OD600值，以空白培養(yǎng)基作為對照。

1.2.4 菌株產硝酸還原酶曲線［11］菌體收集:將菌株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37℃活化2次，然后按4%的接種量接種到有100mL增殖營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)，第4h開始，每隔4h取菌懸液，4℃，10000r/min離心10min收集菌體。

硝酸還原酶的誘導:用誘導緩沖液(10g/L蛋白胨、1g/L KNO3和1g/L半胱氨酸，調pH7.0)調OD540=1.0，取出一半的懸浮液離心后，菌體重新懸浮在0.85%無菌的生理鹽水中，再次離心。重復操作1次，以洗去殘余培養(yǎng)基，在90℃烘干，稱重。

硝酸還原酶活性測定:從另外一半懸浮液中取1mL置于微量離心管中，并在液面上覆蓋一層無菌石蠟，30℃反應2h后取出離心，細胞重新懸浮在反應緩沖液(50mmol/L KNO3，50mmol/L磷酸鉀，100mmol/L NaCl，pH7.0)，并加入30μL 的丙酮-甲苯(9∶1)，混勻后室溫條件下劇烈振蕩5min作透性化處理，然后置于30℃反應30min。反應液離心后，取出上清液100μL，加入2mL水，2mL Griess試劑顯色。以不加菌體細胞的反應緩沖液和檢測液為空白對照，用分光光度計在波長540nm處測定吸光值。從亞硝酸鹽標準曲線計算出酶活。以每毫克細胞干重產生NO-2的量來表示。

1.2.5 發(fā)酵香腸生產工藝的單因素實驗 將木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌按照不同的接種量、菌株配比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間依照發(fā)酵香腸工藝流程，依照不同的要求條件，接種到中式香腸產品中，測定最終產品的紅度值a及亞硝酸鹽殘留量。選擇出紅度值較高且亞硝酸鹽殘留量低的各單因素參數(shù)作為較優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.2.6 正交實驗設計 前面實驗初步確定出各單因素的優(yōu)化值。本實驗以發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、接種量(C)、菌種配比(D)為研究對象進行正交實驗。測定指標以亞硝酸鹽殘留量為主，同時兼顧產品色澤，通過對各指標的影響因素進行客觀分析，選擇出S.xylosus和S.carnosus作用于天然發(fā)酵香腸的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)，即亞硝酸鹽殘留量較低且產品品質較好的發(fā)酵條件。

實驗選擇4因素3水平，采用L9(34)正交表，各因素水平見表1。

表1 發(fā)酵香腸生產工藝正交實驗的因素水平表Table 1 The factor levels of orthogonal experiment in fermented sausage processing

1.2.7 正交結果驗證 根據(jù)上述實驗所得出的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，本實驗欲通過對該工藝條件下色澤和亞硝酸鹽殘留量的測定，對實驗結果進行驗證。據(jù)此，實驗設計以傳統(tǒng)發(fā)酵工藝為對照，即直接添加亞硝酸鈉150mg/kg，發(fā)酵條件則為正交實驗所確定的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.2.8 發(fā)酵香腸的紅度值a和亞硝酸鹽含量的測定方法 取多根香腸的部分切成1cm薄片，用聚乙烯薄膜將被測面壓平，除去氣泡，立即用色差計探頭平壓在腸片肌肉組織表面，記錄a值［12］。

亞硝酸鹽含量采用GB 5009.33-2010方法。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 每個樣品實驗重復三次，取平均值。用 SPSS 11.5和 Excel 2003對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與討論

2.1 菌株生長曲線

從圖1看出，木糖葡萄球菌在培養(yǎng)4h后進入對數(shù)生長期，17h后進入穩(wěn)定期;肉糖葡萄球菌在培養(yǎng)6h后進入對數(shù)生長期，17h后進入穩(wěn)定期。

對數(shù)期的微生物，生理特性整體較一致，酶系活躍，代謝旺盛，所以選用對數(shù)期的菌種作為實驗菌種。

圖1 菌株生長曲線Fig.1 Growth curves of S.xylosus and S.carnosus

2.2 菌株產硝酸還原酶曲線

由圖2可知，木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌產酶曲線趨勢相似。從圖1可知，在0～4h時，兩菌株處于停滯期，由于細胞數(shù)量較少，因此酶活也較低。在4～16h時處于對數(shù)生長期，此時細胞生長速度快菌體大量繁殖，酶活也逐漸升高，在16h左右酶活達到最大值。17h進入穩(wěn)定期，此時營養(yǎng)物質耗盡，且毒素等有害物質的積累，使新繁殖的細胞數(shù)與衰亡的細胞數(shù)相等，酶活略微有所下降。因此，選擇菌齡16h的菌株作為實驗用菌株。

圖2 菌株產硝酸還原酶曲線Fig.2 Nitrate reductase curve of S.xylosus and S.carnosus

2.3 發(fā)酵香腸生產工藝的單因素實驗

2.3.1 接種量單因素實驗 根據(jù)實驗設計，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間為24h，菌種配比為1∶1。單因素變量為菌株添加量(cfu/g)，水平為 106、107、108。測定結果與傳統(tǒng)發(fā)酵香腸(即添加亞硝酸鹽)做對比。紅度值a值和亞硝酸鹽殘留量的測定結果見圖3、圖4。

分析圖3，從a值角度考慮，在上述三個添加量水平上沒有明顯變化，但其護色效果與對照組很接近;而從亞硝酸鹽殘留量角度來考慮，菌株添加量107cfu/g時效果最佳。所以，綜合考慮肉葡萄球菌選擇107cfu/g左右的接種量為合適的接種量。

圖3 肉糖葡萄球菌接種量對紅度值a和亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.3 Effect of different S.carnosus concentration in redness a and residual nitrite

圖4 木糖葡萄球菌接種量對紅度值a和亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.4 Effect of different S.xylosus concentration in redness a and residual nitrite

分析圖4，同樣以傳統(tǒng)發(fā)酵香腸為對照(即添加亞硝酸鈉)，從a值角度考慮，這三個水平上有一定差異，且菌株添加量為107cfu/g時護色效果優(yōu)于傳統(tǒng)工藝;而從亞硝酸鹽殘留量角度來看，雖然三個水平下沒有顯著差異，但都低于傳統(tǒng)工藝。因此不難得出木糖葡萄球菌的最適接種量也為107cfu/g。

2.3.2 最佳菌種配比單因素實驗 根據(jù)實驗設計，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間為24h，菌種接種量取上述優(yōu)化條件107cfu/g。單因素變量為木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌菌種配比，水平為 1∶1、1∶2、2∶1。實驗結果見圖5。

圖5 菌種配比對紅度值a和亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.5 Effect of strains ratio in redness a and residual nitrite

圖5顯示了不同菌種配比下的亞硝酸殘留量和紅度值a值，表明在配比為 S.xylosus∶S.carnosus=1∶2時，其a值顯著優(yōu)于對照組，且亞硝酸鹽殘留量最低。所以選擇1∶2作為優(yōu)化的菌株配比。

2.3.3 發(fā)酵溫度單因素實驗 根據(jù)實驗設計，發(fā)酵時間為24h，優(yōu)化后的菌株添加量為107cfu/g，菌種配比為1∶2。單因素變量為發(fā)酵溫度(℃)，水平為30、35、40、45。紅度值a和亞硝酸鹽殘留量測定結果見圖6。

表2 發(fā)酵香腸生產工藝正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal experinent for fermented sausages

圖6 發(fā)酵溫度對紅度值a和亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature in redness a and residual nitrite

從圖6分析可知，發(fā)酵溫度為35℃和40℃時，對紅度值a的影響沒有顯著差異;而35℃的亞硝酸鹽殘留量顯著低于40℃。因此，將發(fā)酵溫度控制在35℃左右最為適宜。

2.3.4 發(fā)酵時間單因素實驗 根據(jù)實驗設計，發(fā)酵條件選用上述實驗得出的優(yōu)化參數(shù)，發(fā)酵溫度為35℃，菌株添加量為107cfu/g，菌種配比為1∶2。單因素變量為發(fā)酵時間(h)，水平為 18、24、30、36、42。實驗結果見圖7。

圖7 發(fā)酵時間對紅度值a和亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.7 Effect of fermentation time in redness a and residual nitrite

從圖7分析可知，隨著發(fā)酵時間的變化，a值呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，即18h時護色效果最佳;而亞硝酸鹽殘留量在18h最高，隨后逐漸降低，在24h后沒有出現(xiàn)顯著變化。綜合兩者考慮，選擇24h作為發(fā)酵時間比較適宜。

2.4 正交實驗結果

根據(jù)上述發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、接種量(C)、菌種配比(D)對發(fā)酵香腸護色效果和亞硝酸鹽殘留量的影響結果，進行L9(34)正交實驗，以確定最適宜的發(fā)酵條件。正交實驗結果見表2。

從表2的極差大小可以看出，菌株接種量對a值的影響最大，其次為發(fā)酵溫度;對于亞硝酸鹽殘留量而言，發(fā)酵溫度為主要影響因素，其次為菌種配比。

由于以上各個指標單獨分析出來的最優(yōu)條件并不一致，必須根據(jù)各因素對主要指標影響的主次順序綜合考慮，經(jīng)綜合分析確定，最優(yōu)的發(fā)酵工藝參數(shù)條件為:A1B3C2D2，即發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為30h，發(fā)酵菌株接種量為107cfu/g，發(fā)酵菌種配比為1∶2。

2.5 優(yōu)化條件驗證實驗

根據(jù)上述實驗所得出的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，通過對該工藝條件下a值和亞硝酸鹽殘留量的測定，對實驗結果進行驗證。以傳統(tǒng)發(fā)酵工藝為對照，即直接添加亞硝酸鈉150mg/kg，發(fā)酵條件則為正交實驗所確定的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)，即發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為30h，發(fā)酵菌株接種量為107cfu/g，發(fā)酵菌種配比為1∶2。實驗結果如表3所示。

表3 優(yōu)化條件指標測定表Table 3 The results of optimal conditions

從表3可以看出，優(yōu)化條件下的護色效果優(yōu)于對照組，且亞硝酸鹽殘留量顯著低于對照組，證明該優(yōu)化工藝條件較為理想。

3 結論

本研究通過測定木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌的生長曲線和產硝酸還原酶曲線，確定培養(yǎng)16h的菌株為實驗發(fā)酵菌株;通過發(fā)酵參數(shù)的單因素實驗，以色澤a值和亞硝酸鹽殘留量為指標，以傳統(tǒng)發(fā)酵香腸生產工藝為參照，從單因素實驗中選擇出了較優(yōu)化的發(fā)酵工藝參數(shù):菌株接種量為107cfu/g、菌種配比為 S.xylosus∶S.carnosus=1∶2、發(fā)酵溫度為 35℃、發(fā)酵時間為24h。再進行正交實驗，以色澤a值和亞硝酸鹽殘留量為指標，經(jīng)綜合分析確定，最優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為30h，發(fā)酵菌株接種量為107cfu/g，發(fā)酵菌種配比為1∶2。經(jīng)驗證實驗證明，在該優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下生產的發(fā)酵香腸亞硝酸鹽殘留量為6.2mg/kg，且達到了良好的護色效果。

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Research of the effect of celery powder on color and process optimization of natural Chinese fermented sausages

HUAN Yan-jun1，ZHAO Ya-juan1，ZHAO Jie2
(1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.Nantong shouxingfood Co.，Ltd.，Nantong 226531，China)

TS251.1

B

1002-0306(2012)12-0294-05

2011-09-08

郇延軍(1963-)，男，博士，副教授，研究方向:肉品科學與品質控制。

國家自然科學基金課題(31071569)。