周艷紅 (唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河北 唐山 063000)

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是含有9種酶蛋白分子的家族，可以導(dǎo)致基質(zhì)膜和細(xì)胞間質(zhì)成分破壞與降解，在惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。近年來研究證明MMP-2在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中起了關(guān)鍵作用〔1〕。本研究擬探討MMP-2與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取唐山市協(xié)和醫(yī)院2005～2007年間資料齊全的結(jié)直腸癌標(biāo)本存檔蠟塊53例，正常人黏膜組織37例;年齡41～75(平均56)歲;以上標(biāo)本均經(jīng)病理證實?；颊咝g(shù)前均未進行放療、化療或激素治療。結(jié)直腸癌臨床分期采用TNM方案。Ⅰ期+Ⅱ期22例，Ⅲ期+Ⅳ期31例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性33例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性20例。

1.2 試劑 Trizol為美國 Promega公司產(chǎn)品。引物由大連寶生物公司合成，RT-PCR試劑盒為大連寶生物公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。兔抗人MMP-2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) ①RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄:參照Trizol試劑說明書進行，取1 μg總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。②PCR:應(yīng)用Omiga2.0設(shè)計 MMP-2和β-actin引物，見表1。按RT-PCR試劑盒操作，循環(huán)條件:預(yù)變性94℃2 min;變性94℃ 30 s;退火55℃ 30 s;延伸72℃ 45 s;35個循環(huán)后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用凝膠自動成像2000系統(tǒng)掃描，并以β-actin校正作相對量分析，數(shù)值以兩者吸光度的比值表示。

表1 PCR引物

1.4 免疫組織化學(xué)檢測 采用SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作，用已知的結(jié)直腸癌癌陽性組織切片做陽性對照，用PBS代替一抗做空白對照。

1.5 結(jié)果判定 陽性反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和陽性反應(yīng)強度兩項指標(biāo):陽性著色細(xì)胞數(shù)＞15%定為陽性表達(dá);陽性反應(yīng)強度以淺黃色為弱陽性(+)、黃色或棕黃色為中等陽性()，棕色或者深棕色為強陽性())，無棕黃色或與背景著色一致為陰性(－)。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2 mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá) 結(jié)直腸癌組織中MMP-2 mRNA水平(0.821 8±0.033 75)明顯高于正常結(jié)直腸黏膜組織(0.671 2±0.025 05)，平均為正常結(jié)直腸黏膜組織的1.22倍(以 MMP-2/β-actin灰度比值代表 MMP-2之 OD值)(t=7.060，P ＜0.01)，見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌及正常結(jié)直腸黏膜組織中MMP-2 mRNA表達(dá)

2.2 MMP-2蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá) MMP-2陽性表達(dá)部位主要在細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒，細(xì)胞膜有少量表達(dá)。與正常黏膜組比較，結(jié)直腸癌組MMP-2陽性表達(dá)率呈上升趨勢〔3例(8.1%)vs 40 例(75.5%)〕(χ2=16.729，P ＜0.01)。

2.3 MMP-2與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 MMP-2在高、中、低分化癌組織中的表達(dá)分別為75.0%(15/20)、70.0%(14/20)、84.6%(11/13)(χ2=0.913，P=0.633)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;MMP-2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組表達(dá)率93.9%(31/33)顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組〔45.0%(9/20)〕(χ2=16.111，P=0.001);直腸癌Ⅲ+Ⅳ期中 MMP-2陽性表達(dá)率〔96.8%(31/33)〕顯著高于Ⅰ +Ⅱ期〔45.5%(10/22)〕(χ2=18.307，P=0.001)。

3 討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多環(huán)節(jié)多步驟的癌細(xì)胞與宿主細(xì)胞相互作用的連續(xù)過程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離、侵犯周圍局部組織、進入循環(huán)系統(tǒng)、停留于已形成的血管床、外滲入靶器官間質(zhì)以及在遠(yuǎn)隔器官增生形成轉(zhuǎn)移灶等。MMPs是一族蛋白酶，在哺乳動物中有24個成員，參與細(xì)胞外基質(zhì)降解，其表達(dá)異常與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，成為研究惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的熱點〔2〕。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在多種腫瘤組織中(如肺癌、胃癌、食管癌、卵巢上皮癌、宮頸癌等)表達(dá)水平均顯著高于相應(yīng)正常黏膜組織，同時發(fā)現(xiàn)MMP-2水平與腫瘤分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示MMPs與腫瘤進展相關(guān)，并指出了為腫瘤干預(yù)治療而對MMPs進行研究的重要性〔3～7〕。國外學(xué)者Roeb等〔8〕在對20例結(jié)腸癌、10例直腸癌患者進行研究時發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸組織中MMP-2及MMP-9在腫瘤組織中水平均顯著高于相應(yīng)正常黏膜組織，以MMP-9升高明顯;而在直腸腫瘤中，僅MMP-2水平顯著增高。本研究結(jié)果提示MMP-2與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，MMP-2高表達(dá)的患者，癌組織分化更低，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其具體的作用機制可能與參與細(xì)胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)。

1 馬 莉，張桂華，戚 鳳.基質(zhì)金屬蛋白酶-2與腫瘤關(guān)系的研究進展〔J〕.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2009;25(10):1524-5.

2 Benassi MS，Gamberi G，Magagnoli G，et al.Metalloproteinase expression and prognosis in soft tissue sacomas〔J〕.Ann Oncol，2001;12(1):75-80.

3 常延河，鄭素琴，伊 雪，等.KISS-1和MMP-2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010;20(19):2937-40.

4 華 敏，朱 宏，馮亞東，等.MMP-2、Cox-2蛋白在胃癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.南通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010;30(5):319-21.

5 葉曉鋒，高 平，韓恩善，等.MMP-2和PTEN蛋白在食管鱗癌中表達(dá)及臨床意義〔J〕.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2010;32(11):980-1.

6 高義軍，韓 萍，戴 琪，等.MMP-2在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.西部醫(yī)學(xué)，2010;22(11):2000-2.

7 羅曉華，龐 霞，張占薪，等.VEGF-C、VEGFR-3和MMP-2在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔J〕.中國婦幼保健，2010;25(36):5384-6.

8 Roeb E，Dietrich CG，Winograd R，et al.Activity and cellular origin of gelatinases in patients with colon and rectal carcinoma〔J〕.Cancer，2001;92(24):2680-91.