任占秀 曹 丹 高 超 羅曉光 任 艷 何志義

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001)

近年來，越來越多的研究者認(rèn)為腦內(nèi)炎癥引起小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)可能是帕金森病(PD)發(fā)病機(jī)制的一個重要因素〔1〕。日常生活中，人們會遇到各種體內(nèi)體外的有害刺激，這種外周的刺激會對中樞免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響〔2〕，使之激活。雖然每一次有害刺激不都是致病性的，但在反復(fù)多次非致病性有害刺激下，有可能會積累造成腦內(nèi)免疫環(huán)境的改變，導(dǎo)致或促進(jìn)了腦內(nèi)慢性炎癥過程，成為PD發(fā)病的基礎(chǔ)〔3〕。既往的PD炎癥動物模型研究，大多向黑質(zhì)內(nèi)單次注入致病劑量(＞2 μg)的LPS〔4〕，模擬的是腦內(nèi)急性炎癥反應(yīng)過程，不能真正反映PD的慢性炎癥的病變環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)向黑質(zhì)內(nèi)反復(fù)多次注入亞損傷劑量的LPS，力圖以更接近PD自然病程的方式模擬腦內(nèi)反復(fù)慢性炎癥的過程，觀察其對腦內(nèi)慢性炎癥環(huán)境形成的作用，以及對小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能及多巴胺神經(jīng)元存活的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制作

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 大鼠腦立體定位儀(日本NARISHIGE 公司，型號:SN-3)，LPS(Sigma)，PBS(Sigma)，10% 水合氯醛。健康雄性SD大鼠兩月齡 (體重200～250 g)(由中國醫(yī)科大學(xué)動物部提供)30只。酪氨酸羥化酶(TH)抗體:Cell Signaling#2792，小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1)抗體:日本 Roth公司 Code No.019-19741;SP試劑盒，福州邁新，大鼠抗兔/鼠。大鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒:博士德公司，武漢。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)過程 30只SD大鼠隨機(jī)分為LPS一次注射組、PBS四次注射組和LPS四次注射組。LPS一次注射組大鼠右側(cè)黑質(zhì)部注入 0.5 μg(0.25 μg/μl)LPS，LPS 四次注射組大鼠腦右側(cè)黑質(zhì)部注入 0.5 μg(0.25 μg/μl)LPS，PBS 四次注射組大鼠腦右側(cè)黑質(zhì)部注入等體積PBS，后兩組每月注射一次，共注射四次。每只大鼠分別以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。以前囟為標(biāo)志確定黑質(zhì)SN給藥點(diǎn)的三維坐標(biāo)圖，即前囟后4.4 mm，中線右旁1.2 mm，硬腦膜下7.8 mm。將0.5 μg LPS或者2 μl PBS在10 min內(nèi)緩慢注入黑質(zhì)部，留針5 min后緩慢退出注射器。在每組最后一次注射后一個月，心臟灌流后固定取材。

1.2 切片制作及免疫組化染色 10%水合氯醛腹腔注射麻醉。左心室多聚甲醛灌流，迅速取腦，隨后多聚甲醛后固定，二甲苯透明，包蠟，進(jìn)行4 μm連續(xù)切片。染色時對照大鼠解剖圖譜取包含黑質(zhì)部位切片。每隔5張取一張片子，每組各取10張。常規(guī)脫水后，先經(jīng)3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，繼之用高壓鍋法3 min抗原修復(fù)，自然晾涼至室溫，山羊血清封閉15 min，棄去血清不洗。直接加TH一抗(1∶200)或Iba1一抗(1∶200)4℃過夜，二抗用大鼠抗兔/鼠SP試劑盒，TH用DAB顯棕黃色，顯微鏡下控制顯色時間，去離子水終止反應(yīng)。中性樹脂封片，Iba1用AEC顯紅色，直接水性封片劑封片。顯微鏡下觀察。

ELISA法檢測各組大鼠腦黑質(zhì)部TNF-α、IL-1β炎癥介質(zhì)含量。動物處死后，迅速分離出大鼠左右腦黑質(zhì)部，冰上操作，生理鹽水沖去血液，放入EP管中，眼科剪子剪碎，勻漿器勻漿，分別按照TNF-α、IL-1β的ELISA試劑盒說明，在抗體包被的96孔板中分別加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白和待測樣品，置于4℃搖床過夜，以試劑盒帶的洗滌液洗滌，加入一抗，37℃ 2 h，洗滌，再加入HRP二抗，洗滌后TMB顯色，以96孔酶標(biāo)計(jì)數(shù)儀檢測光密度值。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù) 首先檢查切片的對稱性，切片左右不對稱的大鼠切片不用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，每只大鼠隨機(jī)取包含黑質(zhì)的中腦切片5張，在40倍顯微鏡下計(jì)數(shù)兩側(cè)黑質(zhì)有完整細(xì)胞體的TH陽性細(xì)胞，計(jì)算各組與LPS一次注射組黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)的百分比(各組黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)/LPS一次注射組黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)×100%)，最后5張切片進(jìn)行平均。同時在400倍顯微鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。根據(jù)其形態(tài)分為3期:靜止期(小細(xì)胞體，許多細(xì)小突起)，激活期(細(xì)胞體變大，短粗突起)，活化期(偽足或圓形細(xì)胞體無突起)。每張切片均由3人采用盲法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 見圖1。

圖1 各組黑質(zhì)部小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(AEC顯色，Iba1一抗1∶200)

2.2 各組多巴胺神經(jīng)元生長情況 見圖2。LPS一次注射組，多巴胺神經(jīng)元分布形態(tài)完整，數(shù)量無減少，TH計(jì)數(shù)為186.4±3.7;PBS四次注射組，多巴胺神經(jīng)元數(shù)量少量減少，TH計(jì)數(shù)為152.7±3.9，與LPS一次注射組的比值為81.9%，二組間比較無顯著差異(P＞0.05);LPS四次注射組多巴胺神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，TH計(jì)數(shù)為95.5±6.9，與LPS一次注射組的比值為51.2%，二組間比較差異顯著(P＜0.05)。

2.3 ELISA檢測結(jié)果 見圖3。與LPS一次注射組相比，PBS四次注射組TNF-α、IL-1β含量略增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);LPS四次注射組TNF-α、IL-1β含量相對于LPS一次注射組及PBS四次注射組明顯增多(P＜0.05)。

圖2 各組右腦黑質(zhì)部多巴胺神經(jīng)元免疫組化染色DAB顯色(×40，TH 一抗1∶200)

圖3 各組黑質(zhì)部炎性因子含量變化情況(ELISA法)

3 討論

本文僅一次注入低劑量(0.5 μg)LPS后，黑質(zhì)部小膠質(zhì)細(xì)胞在一個月后呈正常靜止?fàn)顟B(tài)，多巴胺神經(jīng)元數(shù)量也沒有減少，可見此劑量的LPS對小膠質(zhì)細(xì)胞的功能形態(tài)及多巴胺神經(jīng)元存活和腦內(nèi)炎癥環(huán)境沒有太大影響。說明0.5 μg LPS對于本實(shí)驗(yàn)是一種亞損傷劑量。但在LPS四次注射組，炎性因子釋放增多，提示腦內(nèi)形成炎性環(huán)境，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，多巴胺神經(jīng)元數(shù)量減少，說明反復(fù)多次注入低劑量LPS能夠?qū)е履X內(nèi)慢性炎性環(huán)境，積累刺激使小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及功能均發(fā)生改變，對多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生毒害作用。

本實(shí)驗(yàn)中LPS四次注射組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常改變，符合功能障礙或老化小膠質(zhì)細(xì)胞的特征〔5〕，功能障礙的小膠質(zhì)細(xì)胞在退行性疾病進(jìn)程中的作用已被許多證據(jù)證明〔6〕。因此我們推測，在本實(shí)驗(yàn)中，是這種形態(tài)異常的小膠質(zhì)細(xì)胞參與了TH神經(jīng)元的死亡。

已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠腦內(nèi)注射非致病劑量LPS不會對多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生損害作用，但是可以增加多巴胺神經(jīng)元變性的敏感性〔7〕，小膠質(zhì)細(xì)胞的反復(fù)激活，會使小膠質(zhì)細(xì)胞的端粒酶消耗，最終導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞衰老，產(chǎn)生功能障礙，發(fā)揮有害作用，使敏感的多巴胺神經(jīng)元死亡。由于小膠質(zhì)細(xì)胞對外界環(huán)境異常敏感，因此PBS四次注射組實(shí)際上模擬了四次機(jī)械性刺激，結(jié)果小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)未見明顯變化，多巴胺神經(jīng)元數(shù)量相對于LPS一次注射組少量減少，炎性因子少量增加，雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也從側(cè)面說明非致病性刺激反復(fù)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，會導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及功能發(fā)生改變。

小膠質(zhì)細(xì)胞的激活主要產(chǎn)生兩種神經(jīng)炎性因子:TNF-α，IL-1β。TNF-α是炎癥反應(yīng)的啟動物質(zhì)，其釋放失控，將產(chǎn)生更多炎癥介質(zhì)，并相互作用，形成炎性因子網(wǎng)絡(luò)，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，使致炎因子與抗炎因子之間的平衡失調(diào)，炎癥反應(yīng)過度，實(shí)驗(yàn)表明腦內(nèi)TNF-α表達(dá)增加對多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生損害作用，而抑制TNF-α則對多巴胺神經(jīng)元有保護(hù)作用〔8〕。IL-1β在炎癥反應(yīng)及其他疾病中，對生理和病理起著重要的調(diào)節(jié)作用，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用促進(jìn)神經(jīng)元的慢性變性壞死。本實(shí)驗(yàn)中LPS四次注射組這兩種炎性因子均增高，表明小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活對多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生有害作用，異常釋放的炎性因子發(fā)揮了重要作用。

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