沈 蓓 吳啟南 陳 蓉 王新勝 袁冬平 伍城穎 陳廣云

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046)

芡實(shí)具有益腎固精、補(bǔ)脾止瀉的功效，素有“水中人參”和“水中桂圓”的美譽(yù)。芡實(shí)水和乙醇提取物有較強(qiáng)的抗氧化和清除OH·自由基和· 自由基的作用〔1，2〕，這為其能延緩衰老提供了基本依據(jù)。芡實(shí)化學(xué)成分復(fù)雜，含氨基酸〔3〕、多糖〔4〕、多酚〔5〕、黃酮〔6〕、不飽和脂肪酸〔7〕、微量元素〔8〕等多種成分，但有關(guān)其延緩衰老有效部位的報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖致小鼠亞急性衰老模型，分別灌胃芡實(shí)乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物高低劑量溶液，觀察小鼠行為和多項(xiàng)腦指標(biāo)變化的方法，評(píng)價(jià)其延緩衰老的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠曠場(chǎng)裝置(上海軟隆科技發(fā)展有限公司);SLY-WMS型Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司);FSH-2A可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī)(金壇市金南儀器廠);LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機(jī)(南京曉曉儀器設(shè)備有限公司);Powerwave X340全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司);芡實(shí)購(gòu)于北京中葛綠元科技有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為為睡蓮科植物芡Euryale ferox Salisb.的干燥成熟種仁。芡實(shí)乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物由實(shí)驗(yàn)室自行制備;D-半乳糖(上海寶曼生物有限公司);一氧化氮合酶(NOS)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);清潔級(jí)昆明種小鼠104只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，合格證號(hào):SCXK(蘇)2009-0002，江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)中有小鼠死亡。

1.2 方法

1.2.1 不同提取物的制備 芡實(shí)乙醇提取物的制備:稱取芡實(shí)整粒2 000 g，用8倍量80%乙醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，減壓濃縮為浸膏。芡實(shí)乙酸乙酯提取物的制備:同上述乙醇提取物的制備，減壓濃縮后的浸膏用水混懸，以少量多次原則，乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浸膏，干燥備用。芡實(shí)正丁醇提取物的制備:稱取芡實(shí)整粒2 000 g，用8倍量水飽和正丁醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，減壓濃縮為浸膏。臨用前用生理鹽水配成所需濃度。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 將昆明種小鼠隨機(jī)分為8組，每組13只，分別為對(duì)照組、模型組、芡實(shí)乙醇提取物高、低劑量(500、250 mg·kg－1·d－1)組、芡實(shí)乙酸乙酯提取物高、低劑量(300、150 mg·kg－1·d－1)組、芡實(shí)正丁醇提取物高、低劑量(100、50 mg·kg－1·d－1)組，以上三種提取物高、低劑量分別換算成生藥量均一致。模型組和給藥組每日上午腹腔注射D-半乳糖500 mg·kg－1·d-1，空白組注射等量生理鹽水，下午給藥組分別灌胃相應(yīng)濃度的藥物，空白組和模型組分別灌胃等量的生理鹽水，給藥量均為0.1 ml/10 g，連續(xù)42 d，并用曠場(chǎng)和Morris水迷宮裝置測(cè)試模型制備的成功。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 各組小鼠給藥42 d后，將其置于曠場(chǎng)中央，開始計(jì)時(shí)，用Anymaze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)記錄并分析小鼠90 s內(nèi)的自主探究情況，包括運(yùn)行軌跡、在周邊區(qū)和中央?yún)^(qū)的運(yùn)動(dòng)速度、總區(qū)域跨行次數(shù)等。每實(shí)驗(yàn)完1只小鼠將曠場(chǎng)箱打掃干凈，再進(jìn)行下一只的實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn):從造模和給藥第38天開始，每日于注射和灌胃后進(jìn)行訓(xùn)練，上、下午各1次，歷時(shí)5天。將小鼠面向池壁，從平臺(tái)對(duì)角象限固定入水點(diǎn)放入水中，記錄120 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，如未能找到平臺(tái)，則將其引至上面停留10 s，再放回籠中，潛伏期記為120 s?？臻g探索實(shí)驗(yàn):定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，移出平臺(tái)，仍從平臺(tái)對(duì)角象限固定入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)，以衡量小鼠對(duì)水迷宮記憶的獲取能力。

1.2.5 腦組織蛋白質(zhì)、NOS、GSH-Px、AChE活性的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取腦組織冰浴研磨，并用冷生理鹽水制成10%腦勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液按試劑盒方法，測(cè)定腦組織中蛋白質(zhì)、NOS、GSH-Px、AChE 活性。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組相比，模型組小鼠的運(yùn)動(dòng)速度及總跨越次數(shù)均明顯降低(P＜0.01)，與模型組相比，芡實(shí)乙醇、正丁醇提取物高低劑量組、乙酸乙酯提取物高劑量組均可使衰老小鼠的運(yùn)動(dòng)速度及總跨越次數(shù)明顯增加(P＜0.01)。見表1。

表1 芡實(shí)不同提取物對(duì)亞急性衰老小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響()

表1 芡實(shí)不同提取物對(duì)亞急性衰老小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響()

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P ＜0.01，下表同

13 19.89±8.28 9.03±1.46 19.29±4.00模型組 11 10.04±3.242) 4.05±0.962) 10.41±3.342)乙醇提取物高劑量組 13 18.48±7.544) 7.50±2.114) 18.65±4.434)乙醇提取物低劑量組 13 17.56±7.204)6.62±0.862)4)17.88±3.974)乙酸乙酯提取物高劑量組10 18.25±6.474)6.53±1.251)4)16.41±4.061)4)乙酸乙酯提取物低劑量組11 11.18±5.422) 5.13±1.342)13.53±4.962)3)正丁醇提取物高劑量組 13 18.60±5.574) 10.20±1.804)18.24±5.194)正丁醇提取物低劑量組 13 16.53±6.201)4)8.93±2.264) 17.00±5.124)對(duì)照組

2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn) 各實(shí)驗(yàn)組潛伏期和穿越次數(shù)存在一定差異，模型組小鼠與對(duì)照組相比，潛伏期明顯增加(P＜0.01)，穿越次數(shù)減少。其他各給藥組與模型組相比，潛伏期均明顯減少，且穿越次數(shù)明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表2 芡實(shí)不同提取物對(duì)衰老小鼠定位航行和空間搜索實(shí)驗(yàn)的影響()

表2 芡實(shí)不同提取物對(duì)衰老小鼠定位航行和空間搜索實(shí)驗(yàn)的影響()

組別 n 平均潛伏期(s) 穿越原平臺(tái)次數(shù)(次)13 47.97±12.32 4.83±1.72模型組 11 80.89±22.242) 1.33±0.52乙醇提取物高劑量組 13 42.49±16.834) 3.67±1.374)乙醇提取物低劑量組 13 45.04±9.774) 3.50±1.054)乙酸乙酯提取物高劑量組 10 43.83±12.764) 3.33±1.513)乙酸乙酯提取物低劑量組 11 46.61±15.654) 2.67±0.821)4)正丁醇提取物高劑量組 13 38.09±14.201)4) 4.08±1.804)正丁醇提取物低劑量組 13 43.78±14.814) 3.17±1.473)對(duì)照組

2.3 芡實(shí)不同提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px、AChE活性的影響 與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織NOS、AChE顯著性下降或升高(P＜0.05)，GSH-Px活性升高(P＜0.01)。與模型組相比，芡實(shí)乙醇、正丁醇提取物高劑量組NOS活性升高(P＜0.05)，乙醇、正丁醇提取物高低劑量組、乙酸乙酯提取物高劑量組GSH-Px和AChE活性顯著性升高或降低(P＜0.01)。見表3。

表3 芡實(shí)不同提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px、AChE 活性的影響()

表3 芡實(shí)不同提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px、AChE 活性的影響()

組別 n NOS(U/mg) GSH-Px(U/mg)AChE(U/mg)13 0.49±0.16 39.31±3.60 0.65±0.03模型組 11 0.24±0.081) 30.47±1.622) 0.80±0.061)乙醇提取物高劑量組 13 0.38±0.113) 40.04±1.494)0.52±0.061)4)乙醇提取物低劑量組 13 0.35±0.12 37.11±2.924) 0.58±0.044)乙酸乙酯提取物高劑量組10 0.33±0.12 38.00±1.324)0.52±0.012)4)乙酸乙酯提取物低劑量組11 0.26±0.091) 32.83±1.101) 0.66±0.013)正丁醇提取物高劑量組 13 0.39±0.103)51.16±1.462)4)0.48±0.101)4)正丁醇提取物低劑量組 13 0.36±0.17 40.89±0.674)0.54±0.022)4)對(duì)照組

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腹腔注射D-半乳糖的方法來建造亞急性衰老模型，其原理是在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)注射 D-半乳糖，細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，經(jīng)醛糖還原酶催化后還原成半乳糖醇，該物質(zhì)不能被進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，代謝紊亂，氧自由基堆積，最終致機(jī)體衰老。曠場(chǎng)、Morris水迷宮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了芡實(shí)乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物對(duì)亞急性衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用。腦組織抗氧化相關(guān)酶測(cè)試顯示以上三種提取物可以提高亞急性衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px活力，降低 AChE活力。兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著明顯的相關(guān)性，且芡實(shí)正丁醇提取物的作用優(yōu)于乙醇和乙酸乙酯提取物。

NOS在體內(nèi)能催化NO生成，NO既是一種神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種極不穩(wěn)定的強(qiáng)氧化劑，但腦內(nèi)過多的NO沉積會(huì)發(fā)生細(xì)胞毒性反應(yīng)，這可能與誘生型NOS的過表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了小鼠在衰老過程中，NOS活力會(huì)下降且芡實(shí)三種提取物對(duì)衰老過程中NOS的活力起到了一定的影響作用。

GSH-Px是體內(nèi)清除H2O2和許多過氧化物的重要酶〔9〕。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，芡實(shí)乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物能提高亞急性衰老小鼠腦組織GSH-Px的活力，并隨劑量的增高，酶活性有增加的趨勢(shì)，說明芡實(shí)以上三種提取物具有良好的抗氧化能力，能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自由基的清除，從而在抗衰老過程中發(fā)揮作用。

AChE是在膽堿能神經(jīng)元的突觸處水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)的酶，AChE含量的變化在一定程度上可體現(xiàn)膽堿能神經(jīng)元的功能活性。芡實(shí)三種提取物能夠降低亞急性衰老小鼠腦組織AChE的活力，以提高小鼠腦內(nèi)ACh的含量，這可能是芡實(shí)提取物改善衰老引起的學(xué)習(xí)記憶功能下降的機(jī)制之一。

本研究結(jié)果初步表明芡實(shí)乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物均能起到延緩衰老、改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)脂類過氧化物的清除，增強(qiáng)腦組織抗氧化能力，改善膽堿能系統(tǒng)在學(xué)習(xí)和記憶中的作用等實(shí)現(xiàn)。芡實(shí)作為一種藥食兩用的水產(chǎn)品，其藥用價(jià)值正在被逐步挖掘。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了芡實(shí)脂溶性提取物在延緩衰老方面的作用，為芡實(shí)擴(kuò)大臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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