高麗君 齊曉勇 王秀萍 高俊茶 藺 杰 王 超 孫海平 馬艷凱

(河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平呈正相關(guān)，在降低LDL-C的同時(shí)，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及增加逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)不僅能有效抗AS，還能有效逆轉(zhuǎn) AS斑塊。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABCA1)是升高HDL-C及增加RCT的關(guān)鍵基因〔1〕。生理情況下，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的膽固醇，特別是氧化型低密度脂蛋白膽固醇(ox-LDL)以及乙?；兔芏戎鞍啄懝檀?ac-LDL)均可通過(guò)肝臟X受體(LXRα)途徑調(diào)節(jié)ABCA1的表達(dá)〔2〕;過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)也可通過(guò)肝臟LXRα調(diào)節(jié)ABCA1基因的表達(dá)。非諾貝特是PPARα的配體，可升高HDL-C濃度，減少AS的形成。本文擬研究非諾貝特是否通過(guò)影響ABCA1基因的表達(dá)而發(fā)揮抗AS作用以及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 30只雄性健康 Wistar大鼠，體重100～120 g，2月齡，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)708160。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，測(cè)量體重及血脂水平。隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組10只、高脂模型對(duì)照組10只、非諾貝特藥物干預(yù)組10只。全部動(dòng)物均在同一實(shí)驗(yàn)室按清潔級(jí)大鼠要求專人飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合中華人民共和國(guó)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》及倫理要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 應(yīng)用RT-PCR方法測(cè)量各組肝臟和血管中PPARγ mRNA，LXRα和ABCA1 mRNA的表達(dá)。應(yīng)用Western印跡方法測(cè)量肝臟和血管中PPARγ，LXRα和ABCA1蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 非諾貝特對(duì)大鼠肝臟、血管PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)的影響 高脂模型組肝臟PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)水平分別為0.18±0.01和0.35±0.01，與正常對(duì)照組(0.17±0.01和0.32±0.01)相比雖然有輕度的升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。主動(dòng)脈PPARγ mRNA及蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組分別提高了1.21倍和1.15倍，與正常對(duì)照組(0.29±0.02和0.20±0.00)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。非諾貝特藥物干預(yù)后大鼠肝臟的PPARγ mRNA為0.27±0.02，主動(dòng)脈PPARγ mRNA為0.39±0.02，與模型組比較雖有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);大鼠肝臟PPARγ蛋白表達(dá)為0.39±0.02，主動(dòng)脈PPARγ蛋白表達(dá)為0.26±0.01，表達(dá)水平有不同程度的升高，變化趨勢(shì)與mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致。見(jiàn)圖1～圖4。

2.2 非諾貝特對(duì)大鼠肝臟、血管LXRα mRNA及蛋白表達(dá)的影響 高脂模型組大鼠肝臟、主動(dòng)脈的LXRα mRNA及蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。非諾貝特藥物干預(yù)后大鼠肝臟LXRα mRNA為0.60±0.08，主動(dòng)脈LXRα mRNA為0.82±0.07，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);大鼠肝臟LXRα蛋白表達(dá)為0.34±0.01，主動(dòng)脈LXRα蛋白表達(dá)為0.41±0.01，表達(dá)水平均升高，變化趨勢(shì)與mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致。見(jiàn)圖1～圖4。

圖1 各組大鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表達(dá)

圖2 各組大鼠主動(dòng)脈PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表達(dá)

圖3 各組大鼠肝臟PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表達(dá)

圖4 各組大鼠主動(dòng)脈PPARγ、LXRα蛋白表達(dá)

2.3 非諾貝特對(duì)肝臟、血管ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響高脂模型組肝臟ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平分別為0.65±0.08和0.28±0.01，與正常對(duì)照組(0.55±0.03和0.25±0.01)相比雖然有輕度的升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，主動(dòng)脈ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平分別提高了1.157倍和1.16倍，與正常對(duì)照組(0.57±0.06和0.25±0.01)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。非諾貝特藥物干預(yù)后大鼠肝臟ABCA1 mRNA為0.90±0.08，主動(dòng)脈ABCA1 mRNA為1.08±0.09，較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);大鼠肝臟ABCA1蛋白表達(dá)為0.50±0.02，主動(dòng)脈ABCA1蛋白表達(dá)為0.51±0.02，表達(dá)水平有不同程度的升高，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。見(jiàn)圖1～圖3。

3 討論

AS是一種多因素參與的疾病，其病因尚不完全清楚。大量膽固醇脂在巨噬細(xì)胞內(nèi)積聚，形成泡沫細(xì)胞，這是AS形成早期的特征性病理生理過(guò)程。研究表明HDL-C通過(guò)參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，與AS、冠心病發(fā)病危險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。HDL-C的AS保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制是膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)，已經(jīng)證明ABCA1的主要作用是將細(xì)胞內(nèi)膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外并與apoA-I相結(jié)合，形成新生HDL顆粒，啟動(dòng)RCT過(guò)程。因此，ABCA1在RCT和HDL-C生成的起始步驟中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ABCA1的表達(dá)水平與血漿中HDL水平相關(guān) ，即ABCA1表達(dá)增加，血漿中HDL水平隨之增加〔3〕。本研究結(jié)果表明，建立模型后，HDL-C升高和ABCA1輕度升高，原因如下:考慮血脂增高后，刺激膽固醇外流，增加巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量可顯著增加ABCA1的表達(dá)并提高載脂蛋白介導(dǎo)的脂質(zhì)流出。除了膽固醇外，氧化固醇也明顯誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)。ABCA1途徑受損與動(dòng)脈粥樣硬化性炎癥和代謝紊亂有關(guān)，所以ABCA1通路是治療心血管疾病的靶點(diǎn)。

非諾貝特屬于氯貝丁酸衍生物類血脂調(diào)節(jié)藥，通過(guò)抑制ox-LDL和TG的生成并同時(shí)使其分解代謝增多，降低血LDL-C、TC和TG;非諾貝特還通過(guò)減少膽固醇脂轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)升高高密度脂蛋白。吳信超等〔4〕認(rèn)為使用非諾貝特治療，降低甘油三酯有效率為90%，降低膽固醇為74%，增加高密度脂蛋白為67%。說(shuō)明非諾貝特主要是降低甘油三酯，并兼有降低膽固醇和升高HDL-C作用，貝特類還可誘導(dǎo)HDL受體(如SR-B1/CLA-1和ABCA1)過(guò)分表達(dá)，從而增加細(xì)胞膽固醇外流，所以，貝特類可通過(guò)增加“逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)”而減少動(dòng)脈硬化。本研究表明，非諾貝特能降低甘油三酯，升高HDL-C，能升高ABCA1的表達(dá)，可能一種機(jī)制是通過(guò)對(duì)脂質(zhì)、脂蛋白的影響，其機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)顯示:ABCA1 mRNA和蛋白質(zhì)的分布并不總一致的，說(shuō)明存在著轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，在培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中，ABCA1 mRNA和蛋白質(zhì)以很快的速度降解，而apoA-Ⅰ和apoA-Ⅱ阻止了THP-1細(xì)胞中的ABCA1降解，與HDL無(wú)關(guān)。說(shuō)明存在一種穩(wěn)定調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)的因子，具體機(jī)制有待探討。目前研究比較多的在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)ABCA1的因子就是肝X受體/視黃醇X受體(LXRα/RXR)。當(dāng)配體與它們結(jié)合后，核受體LXR和RXR形成異源二聚體，受氧化膽固醇和視黃酸所激活，然后結(jié)合到ABCA1啟動(dòng)子的識(shí)別序列DR-4上，增強(qiáng)ABCA1基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)對(duì)LXR/RXR與ABCAI的基因啟動(dòng)子相結(jié)合研究表明，利用LXR/RXR途徑可促進(jìn)ABCA1基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)外周細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，防止泡沫細(xì)胞的形成，從而可以防治AS。

PPARs屬于核激素受體超家族成員。研究發(fā)現(xiàn)PPARs有α、β、γ三種亞型，可以通過(guò)與LXR或RXR結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)節(jié)如ABCA1等的靶基因的表達(dá)。PPARγ通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)，增加ABCA1的表達(dá)，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有抑制作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ的人工合成配體羅格列酮能上調(diào)ABCA1蛋白的表達(dá)〔5〕，實(shí)驗(yàn)研究可能通過(guò)PPAR-LXR-ABCA1路徑而實(shí)現(xiàn)。因此，PPAR-α和PPAR-γ激動(dòng)劑很可能是間接通過(guò)活化LXR/RXR途徑來(lái)上調(diào)ABCA1基因轉(zhuǎn)錄的，通過(guò)上調(diào)LXR-α促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄，加速膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)出巨噬細(xì)胞而發(fā)揮抗AS作用〔3〕。PPARγ還具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，抑制一些炎性因子的作用，并可抑制內(nèi)皮素的釋放，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放利鈉肽，使血管擴(kuò)張、改善血管張力發(fā)揮其抗AS的作用繼而減輕斑塊的形成，可能對(duì)AS的防治具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)顯示了應(yīng)用非諾貝特后，肝臟和血管ABCA1升高，同時(shí)LXRα明顯升高，但PPARγ無(wú)明顯升高，表明他的作用可能是通過(guò)其他途徑實(shí)現(xiàn)。PPAR是配體倚賴的轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞核激素受體超家族中的一員，在眾多的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用，PPARα主要調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和炎癥調(diào)控，是貝特類的分子靶標(biāo)。延長(zhǎng)非諾貝特作用時(shí)間以及提高非諾貝特藥物濃度都可引起冠心病患者外周血 ABCA1基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)PPARα的表達(dá)也上調(diào)，作用于LXR/RXR途徑，從而引起人ABCA1轉(zhuǎn)錄過(guò)程的加強(qiáng)。

很多文獻(xiàn)研究許多ABCA1基因的調(diào)節(jié)因素，但是大部分的機(jī)制目前尚不太清楚，而且大多處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，需要進(jìn)一步闡明人的ABCA1基因的調(diào)節(jié)機(jī)制。深入研究ABCA1的功能及其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，無(wú)論對(duì)于脂代謝、AS、冠心病的治療，還是針對(duì)這一環(huán)節(jié)的新藥開(kāi)發(fā)，都具有十分重要的意義。

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2 Attie AD.ABCA1:at the nexus of cholesterol，HDL and atherosclerosis〔J〕.Trends Biochem Sci，2007;32(1):172-9.

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5 茍連平，呂 湛，秦 儉.腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及其受控特點(diǎn)〔J〕.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007;11(10):1943-6.