蔡子平，王宏霞

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 啤酒原料研究所，甘肅 蘭州 730070)

啤酒花 (Humulus lupugusL．)又稱蛇麻草、蛇麻花，是蕁麻目大麻科葎草屬植物，是制造啤酒的原料之一［1］。啤酒花能夠賦予啤酒特殊的苦味和獨(dú)特的風(fēng)味，并具有一定的防腐性能［2］和醫(yī)藥功能。近年來的研究表明，啤酒花不僅具有鎮(zhèn)定、安神、催眠、殺菌、抗炎和利尿等作用，還具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和植物雌激素樣作用等多種功效［3－5］。

啤酒花是一種較耐寒不耐熱的植物，主要分布于我國(guó)西北地區(qū) (新疆北部、東北、華東及山東、甘肅、陜西等地)。目前，我國(guó)啤酒花產(chǎn)量約占全世界的13%，僅次于美國(guó)和德國(guó)，居世界第3位［6］。我國(guó)是世界著名的啤酒花生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，隨著啤酒消費(fèi)和生產(chǎn)的迅速增長(zhǎng)對(duì)啤酒花的產(chǎn)量和質(zhì)量都提出了更高的要求。品種單一老化、甲酸含量低等問題已成為我國(guó)啤酒花種植效益和國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的主要障礙，品種的更新?lián)Q代迫在眉睫。植物組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)作物品種改良方面取得了多方面的成就。啤酒花利用組織培養(yǎng)快繁已有報(bào)道，但側(cè)重于病毒分離方面［7］。

組織培養(yǎng)過程中外植體的選擇、滅菌時(shí)間以及出芽率的高低及苗子質(zhì)量的好壞將直接影響以后的增殖效果［8］。因此，采用科學(xué)的方法快速篩選出合適的外植體及芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基將對(duì)以后試驗(yàn)的順利進(jìn)行有著極為重要的意義。本研究以啤酒花側(cè)枝莖段末為試驗(yàn)材料，對(duì)其滅菌時(shí)間、外植體木質(zhì)化程度、外源激素配比等因素進(jìn)行了篩選，旨在找出適合啤酒花芽誘導(dǎo)的最佳外植體及誘導(dǎo)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

啤酒花枝條采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州試驗(yàn)地，于2011年5月的早晨采集啤酒花當(dāng)年生的側(cè)枝帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.2 材料處理

1.2.1 不同滅菌方法對(duì)啤酒花外植體滅菌與芽誘導(dǎo)效果的影響

將取回的啤酒花枝條去除葉片，在洗潔精溶液中用軟毛刷刷掉表面灰塵后，用自來水沖洗干凈。在超凈工作臺(tái)上，先去掉頂芽，將枝條剪成帶1～2對(duì)腋芽、長(zhǎng)約3.0～5.0 cm莖段，放置于無菌燒杯中。用75%的酒精浸泡30 s后再以0.1%升汞(HgCl2)+吐溫做滅菌劑，滅菌時(shí)間分別設(shè)10，12，14，16 min，共4個(gè)處理。滅菌后用無菌水沖洗莖段5～6次，再將莖段兩端剪掉，剪成帶1對(duì)腋芽、長(zhǎng)1.5～2.5 cm的小段。將經(jīng)消毒的側(cè)芽接入到相同的培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，每處理接種20瓶，每瓶3個(gè)，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)出芽率、污染率，分析比較不同滅菌時(shí)間處理對(duì)啤酒花外植體滅菌與芽誘導(dǎo)效果的影響。

1.2.2 不同木質(zhì)化程度外植體對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

將外植體側(cè)枝分成3個(gè)組，未木質(zhì)化 (側(cè)枝頂芽及以下第1～3個(gè)芽位)作為第1組，半木質(zhì)化 (側(cè)枝第4～8個(gè)芽位)作為第2組，全木質(zhì)化 (側(cè)枝第9個(gè)及以下的芽位)作為第3組。分別以相同的消毒方法將外植體消毒后接入同樣的培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，每處理接種20瓶，每瓶3個(gè)，重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)接種的出芽率，分析不同木質(zhì)化程度外植體對(duì)芽誘導(dǎo)的影響。

1.2.3 不同外源激素對(duì)莖段芽誘導(dǎo)及增殖的影響

保持其他培養(yǎng)條件一致，將幼株莖段按照生理極性分別傾斜插入含有不同濃度IBA、6-BA、IAA相互組合的MS培養(yǎng)基中，所添加的 IAA設(shè)0.1，0.2 mg·L－12個(gè)水平;6-BA 設(shè) 0.01，0.05，0.1 mg·L－13 個(gè)水平;IAA 設(shè)0.1 mg·L－1單水平。每處理接種20瓶，每瓶3個(gè)，重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)及增殖情況，分析不同外源激素對(duì)莖段芽誘導(dǎo)及增殖的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)間對(duì)外植體滅菌和芽誘導(dǎo)效應(yīng)

由表1可知，不同滅菌時(shí)間對(duì)啤酒花外植體的消毒滅菌與芽誘導(dǎo)效果不同。在10～16 min滅菌時(shí)間范圍內(nèi)，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體污染率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，而其死亡率則隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)而依次遞增，其中以滅菌16 min的外植體污染率最低，為30.56%，而死亡率高達(dá)33.89%。

表1 0.1%升汞+吐溫滅菌對(duì)外植體和芽誘導(dǎo)的效應(yīng)

從表1中還可看出，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，外值體芽誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，當(dāng)滅菌14 min時(shí)，外植體芽誘導(dǎo)率最高為50.00%。因此以0.1%升汞處理外植體14 min效果最好，既能降低外植體的污染率，又能提高芽誘導(dǎo)率。

2.2 不同木質(zhì)化程度莖段對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

啤酒花頂端芽因其未木質(zhì)化，分生能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，因此，其出芽率最高。但由于芽較幼嫩，消毒較困難，消毒時(shí)間稍長(zhǎng)易出現(xiàn)白化苗，白化率最高。頂芽以下第4～8芽位處于半木質(zhì)化程度，芽誘導(dǎo)的出芽率較高，白化率低，污染也相對(duì)較少，比較容易消毒，也適合作為芽誘導(dǎo)的材料。第9位及以下的莖段幾乎完全木質(zhì)化，腋芽的出芽率低且污染率高，很難徹底消毒，因此不適合作為芽誘導(dǎo)的外植體。方差分析結(jié)果 (表2)表明，未木質(zhì)化及半木質(zhì)化莖芽的芽誘導(dǎo)率相對(duì)于木質(zhì)化莖段的芽誘導(dǎo)率差異顯著。因此，在啤酒花芽誘導(dǎo)時(shí)應(yīng)用未木質(zhì)化及半木質(zhì)化莖段作為外植體。

表2 不同木質(zhì)化程度莖段對(duì)芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同外源激素對(duì)莖段芽誘導(dǎo)及增殖的影響

將啤酒花莖段接種到添加不同濃度外源激素的MS培養(yǎng)基上15 d后，葉腋處開始萌芽，再過10 d，腋芽開始抽芽，莖段基部開始出現(xiàn)愈傷組織，但愈傷組織未見分化出芽。一般情況下，一個(gè)葉腋萌出3～10個(gè)芽。莖芽分化所得莖段可以繼續(xù)進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，觀測(cè)結(jié)果見表3。

表3 不同激素配比對(duì)啤酒花莖段芽誘導(dǎo)及增殖的影響

表3顯示，MS培養(yǎng)基能培育出啤酒花莖段的愈傷組織和不定芽，可作為啤酒花莖段組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基;6-BA配合IAA和IBA均能誘導(dǎo)出莖段芽的誘導(dǎo)。6-BA配合IAA均能在莖段基部誘導(dǎo)出愈傷組織，但芽誘導(dǎo)率相對(duì)較低。IBA和6-BA配合使用芽誘導(dǎo)率及增殖倍數(shù)較高。綜合分析，處理7誘導(dǎo)率及增殖倍數(shù)均最高，可作為最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合，即 MS+0.2 mg·L－1IBA+0.01 mg·L－16-BA。誘導(dǎo)出的芽生長(zhǎng)旺盛粗壯，無褐化現(xiàn)象，芽誘導(dǎo)率為95.2%，增殖倍數(shù)為9.1。

3 小結(jié)與討論

在植物組織培養(yǎng)中，外植體的消毒滅菌一般采用升汞作為滅菌劑進(jìn)行消毒滅菌，滅菌劑和不同處理時(shí)間對(duì)外植體滅菌效果有不同影響［9］。啤酒花莖段中空，嫩枝密被柔毛和腺毛，給外植體的消毒滅菌帶來一定困難。如滅菌處理時(shí)間太短，啤酒花外植體的內(nèi)生菌難以清除，滅菌不徹底，污染嚴(yán)重;但如滅菌處理時(shí)間太長(zhǎng)，特別是對(duì)于幼嫩、未木質(zhì)化的枝條，由于升汞對(duì)組織細(xì)胞的毒害較大，容易造成其腋芽受傷或者死亡，導(dǎo)致芽誘導(dǎo)率降低。本研究結(jié)果表明，以0.1%升汞處理外植體14 min效果最好，既能降低外植體的污染率，又能提高芽誘導(dǎo)率。

外植體的木質(zhì)化程度直接關(guān)系到腋芽萌發(fā)率［10－12］，啤酒花半木質(zhì)化或未木質(zhì)化莖段光合產(chǎn)物主要用于腋芽的萌發(fā)，營(yíng)養(yǎng)豐富，含內(nèi)源激素多，有利于離體培養(yǎng)時(shí)芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，啤酒花未木質(zhì)化和半木質(zhì)化莖芽的芽誘導(dǎo)率相對(duì)于木質(zhì)化莖段的差異顯著。芽誘導(dǎo)時(shí)應(yīng)采用未木質(zhì)化及半木質(zhì)化莖段作為外植體。

植物組織培養(yǎng)的成功與否涉及培養(yǎng)基成分、外植體類型、外植體滅菌條件、外源激素的種類與濃度、光照條件及植物體自身的一些生物學(xué)特性等，其中外源激素的種類、濃度及其配比對(duì)組織培養(yǎng)起著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果表明，啤酒花莖段芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.2 mg·L－1IBA+0.01 mg·L－16-BA，誘導(dǎo)出的芽生長(zhǎng)旺盛粗壯，無褐化現(xiàn)象，芽誘導(dǎo)率為95.2%，增殖倍數(shù)為9.1。

本研究?jī)H對(duì)啤酒花組織培養(yǎng)過程中外植體選擇、外植體滅菌條件及莖段芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基進(jìn)行研究，要建立啤酒花組織培養(yǎng)體系，還需要對(duì)生根培養(yǎng)基及馴化移栽條件進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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