高子夜 莊亮 陳元

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，即使積極治療，其總的5年生存率也僅有15%[1]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）在大多數(shù)上皮來源的腫瘤中表達增多，其過度表達與腫瘤細胞的增殖、活動、侵襲、凋亡抑制、血管生成相關(guān)。有研究[2,3]表明，EGFR高表達與腫瘤治療抵抗有一定關(guān)系，會導(dǎo)致腫瘤細胞對放射治療不敏感。因此，抑制EGFR表達及其下游激活的通路可能會增加腫瘤細胞對放療的敏感性。放療是各期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者均可采用的治療手段，然而放化療聯(lián)合在增加對腫瘤細胞殺傷作用的同時其副反應(yīng)也隨之增加，所以尋找低毒性藥物與放療聯(lián)合來提高腫瘤的局控率是解決的方法之一。吉非替尼（ZDl839、IRESSA、Gefitinib、易瑞沙）是一種口服的表皮生長因子受體抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs），被用于晚期NSCLC的二線或三線治療[4]。放療可誘導(dǎo)EGFR自身磷酸化及其下游通路的激活，促進腫瘤細胞增殖，抑制凋亡[5]。因此兩種治療方法聯(lián)用在理論上可能會增強NSCLC治療效果。本實驗旨在研究觀察吉非替尼是否對NSCLC細胞株HCC827和H358有放療增敏作用以及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人NSCLC細胞株NCI-H358和HCC827，均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心。其中NCI-H358為EGFR野生型，基因水平大量擴增，對吉非替尼敏感；HCC827為EGFR的E746-A750氨基酸缺失，對吉非替尼敏感。實驗藥品吉非替尼，由阿斯利康公司贈予，稱重研磨溶于DMSO，終濃度為10 mmol/L，分裝后-20oC保存?zhèn)溆?。RPMI-1640培養(yǎng)基為吉諾生物有限公司產(chǎn)品，Histone一抗為Biovision公司產(chǎn)品，細胞核漿蛋白分離提取試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，共聚焦顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人NSCLC細胞株NCI-H358和HCC827接種于含100 mL/L加熱滅火胎牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，置于37oC、50 mL/L CO2、相對濕度90%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞照射 將對數(shù)生長期細胞置于0.5 cm的補償物上，將直線加速器機架角度為180度，以保證相同厚度的劑量建成區(qū)。應(yīng)用6 MV X線按所需劑量輸出劑量照射。

1.2.3 克隆形成實驗測定吉非替尼對H358和HCC827細胞的放療增敏作用 取對數(shù)生長期細胞，用PBS洗2遍后，消化制成細胞懸液。用細胞計數(shù)板計數(shù)后稀釋細胞到合適密度，再按不同照射劑量接種合適細胞數(shù)到60 mm直徑的平皿，每個劑量設(shè)3個副孔。細胞貼壁后對照組只換液，2株細胞HCC827和H358均分別分為2組：單純X線照射組、X線+吉非替尼組，實驗組加1 μmol/L吉非替尼作用24 h后分別用0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy射線照射，然后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天-14天，其間可換液1次-2次。待培養(yǎng)到14天時， PBS漂洗后用甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，自然干燥后低倍顯微鏡下計數(shù)≥50個細胞的克隆數(shù)。以0 Gy組計算克隆形成效率（plating efficicy,PE），計算各個劑量下的細胞存活率（survival fraction,SF），PE=（0 Gy劑量下集落數(shù)/細胞接種數(shù)）×100%，SF=某一劑量照射組細胞形成的克隆數(shù)/（該組細胞種植數(shù)×PE），根據(jù)單擊多靶模型SF2=exp（-αD-βD2）擬合曲線計算得到SF2值，重復(fù)3次。

1.2.4 免疫熒光 胰酶消化細胞接種24孔板，使細胞在蓋玻片上貼壁生長，兩株細胞H358和HCC827均分別分為2組：單純X線照射組、X線+吉非替尼組，實驗組加1 μmol/L吉非替尼作用24 h，以4 Gy X線照射后予以PBS洗，4%多聚甲醛于放療后不同時間固定15 min，PBS洗3遍，0.2% Triton X-100室溫作用15 min，PBS洗3遍，5%山羊封閉血清室溫1 h，加I抗1:80（r-H2AX； EGFR）4oC過夜，PBS洗3遍，避光FITC-II抗（1:50） 37oC孵育50 min，PBS洗，1 μg/mL Hoechst 33342染核15 min，PBS洗，甘油封片，固定至載玻片上，避光放置，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 免疫印記 以4 Gy X線照射細胞，X線+吉非替尼組以1 μmol/L吉非替尼提前24 h預(yù)處理，以放療后不同時間胰酶消化，離心收集細胞，加裂解液提取胞漿胞核蛋白，BCA法測蛋白濃度備用。制備5%濃縮膠，8%分離膠，以60 μg蛋白上樣，電泳，先180 mA轉(zhuǎn)膜90 min，再350 mA轉(zhuǎn)膜90 min，取出EGFR膜，5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，I抗（EGFR 1:1,000； histone 1:500）4oC過夜，PBS洗，HRP-II抗室溫孵育2 h，PBS洗，ECL室溫5 min，于暗室膠片曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析。3次獨立實驗的數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，實驗組與對照組的組間差異比較采用t檢驗分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 克隆形成實驗擬合劑量生存曲線 克隆形成實驗結(jié)果顯示，X線+吉非替尼組H358細胞相比單純X線組的生存曲線有明顯差異，兩個曲線之間分開較大（圖1），該圖中，橫坐標為放療劑量，縱坐標為SF值取對數(shù)，如圖所示，X線+吉非替尼組H358的SF2值明顯小于單純放療組，計算出SF2值，單純X線組SF2值為0.433，加藥組SF2值為0.355，說明加藥組H358細胞對放療更敏感。而對于HCC827細胞，X線+吉非替尼組和單純X線組的生存曲線無明顯差異（圖2），計算出的SF2值，單純放療組為0.223，加藥組為0.242，說明預(yù)先使用吉非替尼可能對HCC827細胞并無明顯的放療增敏效應(yīng)。

圖1 H358細胞單純放療組和加藥組劑量生存曲線Fig 1 H358 cells dose-survival curve

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察放療后不同時間段細胞核內(nèi)γ-H2AX表達情況 激光共聚焦顯微鏡觀察放療后不同時間段核內(nèi)γ-H2AX焦點，對于H358細胞，圖3中藍色底為細胞核，綠色點即為γ-H2AX焦點，結(jié)果顯示，單純X線組（圖3A）γ-H2AX焦點于放療后30 min內(nèi)開始增加，1 h γ-H2AX焦點到達高峰，隨后逐漸較少，到12 h幾乎沒有，24 h完全沒有。X線+吉非替尼組（圖3B）γ-H2AX焦點在各時間段均比單純放療組多，放療后4 h仍可見較多γ-H2AX焦點，到放療后24 h γ-H2AX焦點仍然存在。對于HCC827細胞，圖4中藍色底為細胞核，綠色點即為γ-H2AX焦點。結(jié)果顯示，單純X線組（圖4A）和X線+吉非替尼組（圖4B）兩組間的γ-H2AX焦點在放療后各時間段表達并無明顯差異。

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察放療后EGFR入核情況 激光共聚焦顯微鏡觀察放療后EGFR入核，對于H358細胞，圖5中藍色底為細胞核，紅光則為EGFR，結(jié)果顯示，單純X線組（圖5A）EGFR在放療后30 min開始入核，在1 h處達到高峰，X線+吉非替尼組（圖5B）EGFR在各時間段均多在細胞質(zhì)中表達，無入核趨勢。對于HCC827細胞，圖6中藍色底為細胞核，紅光為EGFR，結(jié)果顯示，單純X線組（圖6A）和X線+吉非替尼組（圖6B）EGFR在各時間段表達情況基本一致，即均在細胞質(zhì)中表達，并無入核現(xiàn)象。

圖2 HCC827細胞單純放療組和加藥組的劑量生存曲線Fig 2 HCC827 cells dose-survival curve

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察H358細胞4 Gy放療后不同時間段細胞核內(nèi)γ-H2AX焦點的情況。A：單純X線組；B：X線+吉非替尼組。Fig 3 Immunostaining for confocal microscopy testing for nuclear γ-H2AX foci of H358 cells after 4 Gy X-ray. A: X-ray group； B: X-ray+Gefitinib group.

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察HCC827細胞4 Gy放療后不同時間段細胞核內(nèi)γ-H2AX焦點的情況。A：單純X線組；B：X線+吉非替尼組。Fig 4 Immunostaining for confocal microscopy testing for nuclear γ-H2AX foci of HCC827 cells after 4 Gy X-ray. A: X-ray group； B: X-ray+Gefitinib group.

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察H358細胞4 Gy放療后不同時間段EGFR入核情況。A：單純X線組；B：X線+吉非替尼組。Fig 5 Immunostaining for confocal microscopy testing for nuclear EGFR foci of H358 cells after 4 Gy X-ray. A: X-ray group； B: X-ray+Gefitinib group.EGFR: epidermal growth factor receptor.

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察HCC827細胞4 Gy放療后不同時間段EGFR入核情況。A：單純X線組；B：X線+吉非替尼組。Fig 6 Immunostaining for confocal microscopy testing for nuclear EGFR foci of H358 cells after 4 Gy X-ray. A: X-ray group； B: X-ray+Gefitinib group.

圖7 Western blot 檢測H358細胞4 Gy放療后不同時間點胞漿胞核中EGFR表達變化情況。A：單純X線組；B：X線+吉非替尼組；C：EGFR帶灰度定量柱狀圖。Fig 7 Western blot testing for cytoplasm and nuclear EGFR of H358 cells after 4 Gy X-ray. A: X-ray group； B: X-ray+Gefitinib group； C: The densitometric analysis of EGFR expression.

圖8 Western blot檢測HCC827細胞4 Gy放療后不同時間點胞漿胞核中EGFR表達變化情況。A：單純X線組；B：X線+吉非替尼組；C：EGFR帶灰度定量柱狀圖。Fig 8 Western blot testing for cytoplasm and nuclear EGFR of HCC827 cells after 4 Gy X-ray. A: X-ray group； B: X-ray+Gefitinib group； C: The densitometric analysis of EGFR expression.

2.4 Western blot檢測放療后胞漿胞核中EGFR表達變化情況 Western blot結(jié)果顯示，對于H358細胞，圖7中單純X線組（圖7A）EGFR在放療后有入核情況，如圖所示，從放療后15 min開始EGFR在胞核中表達增多，到1 h處條帶達最深，呈遞增趨勢，而胞漿中EGFR表達在各時間段則呈遞減趨勢，說明EGFR在放療后從胞漿進入胞核。X線+吉非替尼組（圖7B）EGFR則均在胞漿中表達，且條帶無明顯差異，核內(nèi)EGFR表達很少。采用凝膠成像灰度定量系統(tǒng)計算各條帶的灰度值，并做成柱狀圖（圖7C），對兩組數(shù)據(jù)進行配對t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.031），對照組的灰度值均高于實驗組。這說明H358細胞在放療后1 h內(nèi)，在各個相同的時間點，X線+吉非替尼組細胞核EGFR表達均少于單純X線組，可能是由于吉非替尼通過某種途徑阻止EGFR放療后進核。對于HCC827細胞，單純X線組（圖8A） 和X線+吉非替尼組（圖8B）兩組EGFR在各時間段均在胞漿中表達，胞核中很少或不存在，且胞漿中條帶并無趨勢差異。采用凝膠成像灰度定量系統(tǒng)計算各條帶的灰度值，并做成柱狀圖（圖8C），對兩組數(shù)據(jù)進行配對t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.32），這說明HCC827細胞在放療后1 h內(nèi)，在各個相同的時間點，單純X線組和X線+吉非替尼組這兩組中EGFR表達并無差異，且EGFR蛋白在胞核中表達明顯少于胞漿。

3 討論

EGFR是跨膜糖蛋白受體Erb-B家族成員之一，屬于酪氨酸激酶生長因子受體，此類受體在正常細胞和腫瘤細胞中具有一定程度的表達，與細胞增殖、分化、凋亡、血管生成等密切相關(guān)。當EGFR與相應(yīng)配體（如EGF、TNF-α、Neuregulin等）結(jié)合或暴露于電離輻射、紫外線、高溫、乏氧等環(huán)境中時，會與受體活化形成同源或異源二聚體形式，導(dǎo)致胞內(nèi)酪氨酸激酶活化，促進受體自身磷酸化，激活下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如Ras/Raf/MEK/ERK、PLCv/DAG/PKC、JAK/SRC/STAT以及PBK/AKT途徑，導(dǎo)致細胞異常增殖和分化、血管生成增加并抑制腫瘤細胞凋亡[6]。以放療為主的綜合治療是局部晚期NSCLC的標準治療方案，電離輻射可引起DNA發(fā)生各種類型的損傷，其中雙鏈斷裂（double strands break, DSB）是最致命的損傷形式，因此，抑制放療后DSB修復(fù)是增加腫瘤放射敏感性的核心因素。大量體外研究顯示，EGFR參與了DSB損傷修復(fù)的過程，能夠通過多種途徑來影響腫瘤細胞的放射敏感性。暴露于電離輻射，可以激活EGFR，使核外的EGFR在不依賴配體的情況下進入到細胞核內(nèi)，與DSB修復(fù)的重要蛋白DNA-PK形成蛋白復(fù)合體，促進DNA-PKc磷酸化，實現(xiàn)DSB修復(fù)[7-11]。另外，EGFR也可通過激活下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK及PI3K/PDK1/Akt（PKB）通路來調(diào)節(jié)細胞凋亡、增殖、周期循環(huán)，并影響DSB修復(fù)相關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，從而影響放療敏感性[12,13]。目前針對EGFR的靶向治療已成為NSCLC治療的熱點。EGFR單克隆抗體C225已被單藥或與化/放療聯(lián)合用于臨床。有研究者[14]以頭頸部鱗癌細胞系SCC-13Y作為對象，觀察發(fā)現(xiàn)不論是單次照射還是分次照射，C225均可降低其存活分數(shù)，增加放療后細胞的凋亡率，表現(xiàn)為放射增敏效應(yīng)。還有研究[15]發(fā)現(xiàn)，C225通過抑制放療后EGFR入核與DNA修復(fù)相關(guān)蛋白DNA-PK結(jié)合，增加了肺癌細胞株A549和乳腺癌細胞株MDA MB231的放療敏感性。本研究旨在探討吉非替尼是否有與C225相似的放射增敏效應(yīng)及其可能的機制。

本實驗選取兩株NSCLC細胞株，分別是H358和HCC827。其中H358為EGFR野生型，在基因水平大量擴增，對吉非替尼敏感；HCC827為EGFR的E746-A750氨基酸缺失，對吉非替尼敏感。根據(jù)兩株細胞的IC50以及吉非替尼的半衰期，選取1 μg/mL吉非替尼作為增敏濃度。

本實驗根據(jù)兩細胞株放療后克隆形成情況，計算SF值繪制劑量生存曲線?？梢钥吹紿358細胞X線+吉非替尼組各個劑量的細胞存活率均低于X線組，SF2值也同樣如此。說明前者放療后發(fā)生增殖性死亡的細胞多于后者，大部分細胞因喪失了繼續(xù)增殖生長的能力而不能形成克隆，即吉非替尼使H358細胞的放療敏感性增加。而HCC827細胞實驗組及對照組SF2值并無明顯差異?？寺⌒纬蓪嶒炞C明吉非替尼可提高細胞株H358的放療敏感性，而對細胞株HCC827無明顯放療增敏效應(yīng)。

組蛋白H2AX在DNA發(fā)生DSB時發(fā)生磷酸化，磷酸化的H2AX參與DNA損傷修復(fù)和維持基因組穩(wěn)定性；由于γ-H2AX的數(shù)量與DNA損傷的數(shù)量存在一一對應(yīng)的關(guān)系，因此，γ-H2AX可以作為低劑量電離輻射衡量腫瘤放療敏感性的指示因子[16]。為驗證吉非替尼是否有促進放療后引起的DNA損傷的作用，我們通過共聚焦熒光顯微鏡觀察了放療后不同時間段細胞核內(nèi)γ-H2AX的表達。結(jié)果顯示，對于H358細胞，兩組均可觀察到放療后細胞核內(nèi)γ-H2AX的表達，且在放療后1 h達到高峰，后逐漸減少。但X線+吉非替尼組的γ-H2AX焦點在各個時間點均明顯多于單純X線組，且持續(xù)時間更長，這說明了吉非替尼有增加放療后DSB的效應(yīng)，使得H358細胞放療后DSB形成增多，并延遲了DNA損傷的修復(fù)，表現(xiàn)出放療增敏的作用。對于HCC827細胞，兩組γ-H2AX焦點的變化及持續(xù)時間并無特殊差異，說明放療后兩組DSB大致相同，吉非替尼的預(yù)先處理并未增加HCC827細胞的放射敏感性。

為確定兩株細胞放療后是否有EGFR入核作用，我們通過共聚焦熒光顯微鏡觀察了兩株細胞放療后EGFR的表達位置變化情況。結(jié)果顯示，對于H358細胞，單純X線組EGFR在放療后1 h內(nèi)進入細胞核，并在1 h處達到高峰；而X線+吉非替尼組EGFR光點在各個時間段幾乎都位于細胞質(zhì)內(nèi)，細胞核內(nèi)很少或不存在。而對于HCC827細胞，兩組的EGFR在1 h內(nèi)不同時間點均在細胞質(zhì)中表達，細胞核內(nèi)很少或不存在，兩組并無特殊差異。這說明放療后H358細胞EGFR入核，而HCC827細胞EGFR不入核。而相關(guān)研究[17]也有顯示，野生型EGFR在放療后可入核，并與DNA修復(fù)蛋白DNA-PK結(jié)合完成放療后DSB的修復(fù)，從而達到放療保護的作用；而突變型EGFR放療后不入核，不能與DNA-PK結(jié)合，從而表現(xiàn)出對放療的敏感。 也有研究[18]發(fā)現(xiàn)，如果把突變型EGFR導(dǎo)入對放療耐受的野生型NSCLC細胞，且阻斷野生型EGFR的放療保護作用，擁有突變型EGFR的該細胞不僅表現(xiàn)出其原有的放療保護作用喪失，而且產(chǎn)生了明顯的放射增敏效應(yīng)。

為進一步驗證兩株細胞放療后EGFR入核情況，我們用Western blot檢測了放療后兩株細胞胞質(zhì)、胞核中EGFR的表達。結(jié)果顯示，對于H358細胞，單純X線組在放療后1 h內(nèi)胞漿EGFR表達隨時間減少，胞核EGFR表達隨時間增多，在1 h達到高峰，而X線+吉非替尼組EGFR均在細胞質(zhì)表達，且無變化趨勢，細胞核內(nèi)很少或幾乎沒有EGFR表達；對于HCC827細胞，兩組EGFR在胞質(zhì)和胞核中的表達在各個時間點并無趨勢差異，且組間也無特殊差異，這與共聚焦熒光顯微鏡所觀察到的結(jié)果相同。由于EGFR可通過放療激活進行下游信號通路的傳導(dǎo)，其中野生型EGFR可直接在放療后入核，與DNAPKcs結(jié)合進行DSB修復(fù)起到放療保護的作用，因此我們可以推測，吉非替尼可能是通過抑制放療后EGFR入核與DNA修復(fù)蛋白DNA-PK結(jié)合來增加放療效應(yīng)。

有研究[19]選取多株不同類型NSCLC細胞株進行了體外實驗，結(jié)果顯示，表達突變型EGFR的細胞對放療表現(xiàn)出敏感性，出現(xiàn)放療后DNA修復(fù)受阻；而相反，表達野生型EGFR的多株細胞則出現(xiàn)放療后有效的DNA修復(fù)，并推論出突變型EGFR可能通過阻礙放療后引起的DSB修復(fù)而達到放療增敏作用。還有研究結(jié)果[9]顯示，對于表達野生型EGFR的細胞，在受到電離輻射后，可以入核與DSB修復(fù)的關(guān)鍵蛋白DNA-PK結(jié)合，并可通過免疫共沉淀檢測出EGFR-DNA-PKcs或EGFR-Ku80的復(fù)合體，而這一結(jié)果在表達突變型EGFR的細胞中并未發(fā)現(xiàn)。最近有研究[20,21]指出，吉非替尼的放療增敏作用可能與其抑制了放療后ATM的表達和活性有關(guān)，而這一作用在別的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑如而厄洛替尼中卻并未發(fā)現(xiàn)，且吉非替尼的放療增敏效果受細胞株中COX-2的表達影響，過表達COX-2的細胞容易對吉非替尼產(chǎn)生耐藥從而使其不能發(fā)揮放療增敏作用。

然而，吉非替尼是否還通過其它途徑影響H358細胞和HCC827細胞的放療敏感性；是否阻止EGFR入核后與DNA修復(fù)相關(guān)蛋白DNA-PKCs的結(jié)合來達到增敏作用；抑制DNA-PKcs的活性是否會對核內(nèi)EGFR的表達及放療敏感性產(chǎn)生影響；體內(nèi)實驗與體外實驗是否能得出相同的結(jié)論；吉非替尼與放療聯(lián)用是否有積極的臨床價值，以上問題還需要進一步的體外及體內(nèi)實驗來驗證。

本課題來源于：

1.吳階平醫(yī)學(xué)基金會基金《基于EGFR不同基因型的NSCLC個體化放療機制初探》（No.320.6720.10013；2011.01-2012.12）。

2. 國家自然科學(xué)基金《EGFR備選非小細胞肺癌放療增敏靶點的機制研究》(No.30801351； 2009.1-2011.12）。