高家紅，仝品芬，孫曉梅，江勤芳，代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118)

經(jīng)驗交流

從臨床肺炎死亡樹鼩中分離到致病性大腸埃希菌

高家紅，仝品芬，孫曉梅，江勤芳，代解杰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118)

目的 對6例1月內(nèi)因肺炎死亡的樹鼩采樣進行病原菌分離培養(yǎng)鑒定分析。方法解剖死亡樹鼩，利用無菌刀片切開肺組織，用無菌接種環(huán)插入肺內(nèi)采樣接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，另取兩份樣品進行細菌涂片革蘭氏染色和抗酸染色。培養(yǎng)出來的細菌進行進一步分離和菌落生長情況的觀察，并經(jīng)革蘭氏染色、抗酸染色、氧化酶試驗、生化編碼鑒定和9種藥敏試驗，初步確定樹鼩肺部感染的致病菌及其藥敏情況。結(jié)果樣本革蘭氏染色見到大量陰性桿菌，抗酸染色結(jié)果顯示為非結(jié)核分枝桿菌，大小約為0.2 μm×2～6 μm。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)6例樣品中均僅見1株旺盛生長的細菌，進一步分離培養(yǎng)經(jīng)革蘭氏染色為陰性桿菌，抗酸染色為非結(jié)核分枝桿菌，大小和染色結(jié)果與樣本涂片相同，經(jīng)鑒定為致病性大腸埃希菌。藥敏試驗表明該菌對頭孢哌酮，呋喃妥因，氨芐西林，阿米卡星，氧氟沙星，諾氟沙星，磺胺甲噁唑/甲氧芐定高度敏感;對慶大霉素和青霉素G為低度敏感。結(jié)論6例樹鼩死亡原因均為細菌性肺炎，病原菌初步鑒定為致病性大腸埃希菌。藥敏實驗篩選出的藥物可為臨床治療樹鼩該類病例用藥提供指導(dǎo)。

樹鼩;致病性大腸埃希菌;藥敏試驗

樹鼩(Tupaia belangeri chinensis，tree shrew)是一種在生物醫(yī)學(xué)研究中很有價值的新型實驗動物，近幾十年來，樹鼩已廣泛應(yīng)用于病毒、細菌、寄生蟲、神經(jīng)、內(nèi)分泌、泌尿、腫瘤等方面的研究［1］。

人工飼養(yǎng)狀態(tài)下群養(yǎng)或交配飼養(yǎng)的成年樹鼩常常因飼養(yǎng)條件不適、營養(yǎng)、發(fā)情等原因撕咬致傷致殘，繼而導(dǎo)致突然死亡。該類死亡樹鼩?？梢姷矫黠@的外傷，無腹瀉癥狀，極易判斷死因。單獨關(guān)養(yǎng)的成年樹鼩無任何外觀表現(xiàn)異常而突然死亡的原因應(yīng)進行調(diào)查分析，引起足夠的重視。

本文對我中心6例單獨關(guān)養(yǎng)的樹鼩急性死亡病例進行解剖診斷，確診為肺炎后用細菌學(xué)方法采樣進行了培養(yǎng)、分離、鑒定和藥敏試驗，弄清了導(dǎo)致死亡的原因。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基和主要試劑

營養(yǎng)瓊脂、S．S．瓊脂、三糖鐵培養(yǎng)基、腸桿菌科細菌生化鑒定管、氧化酶試驗試劑盒、革蘭氏染色試劑盒均購自杭州天和微生物試劑有限公司，快速抗酸染色試劑盒購自邁克生物試劑有限公司，藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2 樹鼩細菌采樣涂片和培養(yǎng)

人工飼養(yǎng)的6只成年樹鼩，均來自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長類研究中心【SCXK (滇)2010－0003】【SYXK(滇)2010－0007】，單獨飼養(yǎng)于室內(nèi)不銹鋼籠。平時飼喂由玉米粉、麥粉、奶粉、白糖、雞蛋等配合經(jīng)蒸熟成糕狀的食物，輔食以飼喂蘋果、面包蟲為主。每日清潔一次飲水盒及料盒并清掃糞便。樹鼩發(fā)病前飲食活動均正常，發(fā)病后活動性下降，通常厭食1 d后絕食，次日死亡。尸體解剖見外觀無異常，肛周清潔無腹瀉癥狀，剖見心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、腎上腺、膀胱均正常，胃、大腸、小腸空無，雙肺表面呈眾多白色針尖樣細小結(jié)節(jié)，全肺充血浸潤，急性肺炎典型癥狀明顯。利用無菌刀片切開肺部結(jié)節(jié)部位，用無菌接種環(huán)插入肺內(nèi)病灶采樣接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，將平皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果。另采樣兩份于預(yù)先滴有1滴生理鹽水的潔凈載玻片上進行細菌涂片革蘭氏染色和抗酸染色鏡檢。

1.3 細菌分離培養(yǎng)和染色

挑選營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中的典型菌落用三糖鐵瓊脂鑒別培養(yǎng)基作進一步的分離培養(yǎng)和產(chǎn)酸產(chǎn)氣等培養(yǎng)特征鑒定。挑選分離培養(yǎng)得到的單個菌落涂片按革蘭氏染色試劑盒和快速抗酸染色試劑盒使用說明書分別進行革蘭氏染色和抗酸染色鏡檢。另外轉(zhuǎn)種S．S．瓊脂觀察培養(yǎng)特性。

1.4 氧化酶試驗

將潔凈濾紙條置于干凈平皿內(nèi)，在超潔凈操作臺中用接種環(huán)在分離培養(yǎng)的中管里輕刮一滿環(huán)菌體均勻涂于濕潤的濾紙上，用氧化酶試劑滴在濾紙條細菌培養(yǎng)物上，10 s內(nèi)觀察結(jié)果。紫紅色為陽性，無色或淡黃色為陰性(觀察結(jié)果不明顯時需進行重復(fù)實驗)。

1.5 細菌生化鑒定

取生化編碼鑒定管用砂輪將玻璃管上端劃痕折斷，然后用接種針取分離到的純菌培養(yǎng)物接種(氨基酸及對照管需覆蓋滅菌液體石蠟1～2滴)，置滅菌平皿內(nèi)或小試管架上放35℃培養(yǎng)箱內(nèi)，18～24 h內(nèi)觀察生化反應(yīng)結(jié)果。對照采用大腸埃希菌ATCC25922。

15種腸道桿菌生化編碼鑒定管為:硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對照、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖。

1.6 藥敏試驗

采用K-B紙片法進行［2］，本次所用藥敏試紙片如下:阿米卡星(AN30 μg/片)、青霉素G(P10 μg/片)、頭孢哌酮(CFP75 μg/片)、氨芐西林(AM10 μg/片)、呋喃妥因(FT300 μg/片)。慶大霉素(GM10 μg/片)、諾氟沙星(NOR10 μg/片)、氧氟沙星(OFL5 μg/片)、磺胺甲噁唑/甲氧芐定(SXT 23.75/125 μg/片)。對 照 采 用 大 腸 埃 希 菌ATCC25922。

表1 樹鼩肺炎病原菌藥敏試驗結(jié)果Tab．1 Susceptibility test results of pneumonia pathogenic bacterium in tree shrew

2 結(jié)果

2.1 樣品及其培養(yǎng)分離物革蘭氏染色

樣品及培養(yǎng)物涂片革蘭氏染色在油鏡下均見到大量桿狀紅色細菌，形態(tài)幾乎完全相同，為革蘭氏陰性桿菌，未見其它細菌(彩插4圖1)。

2.2 樣品及其培養(yǎng)分離物抗酸染色

油鏡下樣品及培養(yǎng)物涂片抗酸染色均見到大量細長桿狀藍色細菌，無彎曲和分枝，抗酸染色為陰性，證實該菌為非結(jié)核分枝桿菌(彩插4圖2)。

2.3 細菌培養(yǎng)分離和鑒定

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)6例樹鼩均僅見1株細菌生長，無其它細菌，該菌生長旺盛，菌落呈圓形凸起，半透明，表面光滑濕潤，37℃培養(yǎng)18 h菌落直徑大小約0.5 cm。三糖鐵培養(yǎng)基分離培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，得到的細菌革蘭氏染色為陰性桿菌，氧化酶試驗均為陰性，抗酸染色為非結(jié)核分枝桿菌，大小約為0.2 μm ×2～6 μm，接種 S．S．瓊脂生長迅速，粉紅色菌落，呈云霧狀，經(jīng)細菌生化編碼鑒定為致病性大腸埃希菌，符合率為100%。

2.4 細菌藥敏試驗

細菌藥敏試驗測得的抑菌圈大小見表1。從表中可看出該菌對所試藥物均敏感，其中對頭孢哌酮，呋喃妥因，氨芐西林，阿米卡星，氧氟沙星，諾氟沙星，磺胺甲噁唑/甲氧芐定高度敏感，對慶大霉素，青霉素G為低度敏感。

3 討論

大腸埃希菌通常情況下對人體無害，但也有部分致病性發(fā)生改變了的大腸埃希菌特殊血清型，可以導(dǎo)致消化道感染［3］。在人類，大腸埃希菌引起細菌性肺炎感染的人群主要是新生兒、老年人和體弱多病者，其他人群較少見，且預(yù)后惡劣［4，5］。在實驗動物中，引起肺炎的致病細菌眾多，但少見致病性大腸埃希菌感染的報道。一般情況下成年樹鼩的死亡以咬死和腹瀉較為常見，肺炎相對少見。雖然我們從臨床肺炎死亡的樹鼩新鮮尸體肺臟分離到致病性大腸埃希菌，但同時潛在的聯(lián)合致病因子或其他病原尚未針對性分離或排除，因此分離到的致病性大腸埃希菌盡管從癥狀表現(xiàn)上看很有可能是樹鼩致病致死的主要原因，但不一定是致病致死的唯一原因。盡管如此，值得重視的是本文病例的發(fā)生說明大腸埃希菌有可能導(dǎo)致成年樹鼩急性細菌性肺炎而死亡。

本文病例分離培養(yǎng)檢出的病原菌為致病性大腸埃希菌，該菌很容易通過飲食、環(huán)境接觸而感染，而且只要生長條件適宜，繁殖十分迅猛。因此，我們?nèi)粘ｏ曫B(yǎng)管理中應(yīng)當(dāng)注意樹鼩巢箱、飲食的衛(wèi)生、活動性和排便數(shù)量性狀的觀察記錄，重視氣溫快速變化時采取及時保暖措施提高機體抗病能力。一旦存在病例發(fā)生，應(yīng)引起足夠重視，及時隔離治療，加強飲食衛(wèi)生，有效進行環(huán)境消毒，以防止在群體間迅速傳播。

實驗室內(nèi)樹鼩爆發(fā)間質(zhì)性肺炎已有報告，特點是發(fā)病急，死亡率高，其病原為肺炎支原體［6］。但其他類型的樹鼩肺炎少有報道。由于在解剖中見到白色針尖狀結(jié)節(jié)，因此我們懷疑有結(jié)核分枝桿菌的可能性，故而進行了抗酸染色進行鑒別，結(jié)果證明為非結(jié)核分枝桿菌。但對形成細小結(jié)節(jié)的原因尚不明確，由于直接涂片中都見到大量細菌，推測可能為細菌大量集聚所致。

本次藥敏試驗表明，導(dǎo)致樹鼩死亡的菌株對所試藥物均敏感，這為以后早期發(fā)現(xiàn)病例的治療提供了實驗依據(jù)和藥物選擇上的便利。

［1］ 秦雪，伊瑤，畢勝利，等．樹鼩應(yīng)用于疾病動物模型的研究進展［J］．中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2006，20(2):97－98．

［2］ 孔繁林編．實用臨床細菌鑒定，第一版，昆明:云南科技出版社，1997，64．

［3］ 趙鎧，章以浩，李河民主編．2007．醫(yī)學(xué)生物制品學(xué)，2版．北京:人民衛(wèi)生出版社，1016－1024．

［4］ 胡小平．老年人肺炎的臨床特點及治療(附55例報告)［J］．贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，29(4):579－580．

［5］ 彭啟燦，盧文賽，熊英，等．肺部革蘭氏陰性菌感染的診斷和治療［J］．瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1990，13(3):217－219

［6］ 李媛，楊春，蘇建家，等．實驗室內(nèi)樹鼩爆發(fā)間質(zhì)性肺炎的報告［J］．四川動物，2005，01:21－24．

Isolating Enteropathogenic E．coli from Clinical Pneumonia in Dead Tree Shrews

GAO Jia-hong，TONG Pin-feng，SUN Xiao-mei，JIANG Qin-fang，DAI Jie-jie (Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medicine Sciences(CAMS)＆Peking Union Medical College(PUMC)，
Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research＆Development on Severe Infectious Diseases，Kunming 650118，China)

ObjectiveTo isolate，culture and identify the pathogenic bacterium from 6 cases of bacterial pneumonia within 1 month in tree shrews．Methods We Dissected the dead tree shrew，cut open the lung tissue with sterile blade to insert focus of infection in the lung with inoculating loop to get samples for inoculating on nutrient agar and another two samples for bacterial smear with Gram staining and acid-fast staining．The bacterium obtained was isolated and cultivated for bacterial growth observation，then the pathogenic bacterium of tree shrew and its antibiotic susceptibilities was initially identified by Gram staining，acid-fast staining，oxidase test，biochemistrical encoding identification system and 9-kind antibiotic susceptibility test．Results A amount of negative bacteria were observed from samples with Gram staining．Acid-fast staining appears it was nontuberculous mycobacterium about size 0.2 μm ×2～6 μm．Only 1 strain strong bacterium was observed in every 6 case on nutrient agar plate，it was verified as Gram-negative bacterium and nontuberculous mycobacterium，its size and staining results were the same as samples．It was identified as enteropathogenicE．coli．Antibiotic susceptibility test shows it is highly susceptibility to cefoperazone，furantoin，ampicillin，amikacin，ofloxacin，norfloxacin，sulfonamide methoxybenzyldine and low susceptibility to gentamicin and penicilin．Conclusion We conclude that Bacterial pneumonia is the cause of these 6 tree shrew death cases，the enteropathogenic E．coli．was initially identified as the reason．Drugs selected by antibiotic susceptibility could instruct clinical treatment like these cases in tree shrews．

Tree shrew(tupaia belangeri chinensis);Enteropathogenic E．coli;Antibiotic susceptibility test

R332

A

1671-7856(2012)09-0081-03

10.3969．j．issn．1671.7856.2012.009.018

2012-08-23

“十一五”國家科技支撐計劃項目 (2009BAI83B02、2011BAI15B01)。云南省科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)計劃項目(2006PT07-2)。

高家紅(1968－)，男，碩士，助理研究員，研究方向:實驗動物學(xué)。Email:gjh@imbcams．com．cn。

代解杰(1961－)，男，研究員。E-mail:djj@imbcams．com．cn。