王 吉，衛(wèi) 禮，賀爭鳴，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院、國家實驗動物微生物、遺傳檢測中心，北京 100050)

呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR檢測方法的建立

王 吉，衛(wèi) 禮，賀爭鳴，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院、國家實驗動物微生物、遺傳檢測中心，北京 100050)

目的 建立呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR檢測方法，應用于實驗動物及人用動物源性材料及生物制品外源Reo3的檢測。方法 根據(jù)已發(fā)表的呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)M1基因序列，設計合成引物。提取Reo3細胞毒RNA，以其為模板，進行PCR擴增。優(yōu)化反應條件，進行特異性、敏感性、重復性試驗。結果 建立的Reo3 RT-PCR檢測方法特異、敏感、穩(wěn)定。以Reo3 RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，所能檢測RNA最小模板濃度為0.42pg/μL，可檢測病毒最小滴度為10－9/mL。結論 建立的呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR檢測方法可用于實驗動物及人用動物源性材料及生物制品外源Reo3的檢測。

呼腸孤病毒Ⅲ型;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應;實驗動物;人用動物源性材料及生物制品

呼腸孤病毒3型(Reo3)為呼腸孤病毒科的正呼腸孤病毒屬的代表株。病毒粒子無囊膜，直徑70nm左右。病毒基因組是分節(jié)段雙股RNA(dsRNA)，全基因組分為 L(L1、L2、L3)、M(M1、M2、M3)、S(S1、S2、S3、S4)3 組共 10 個節(jié)段基因組成，共編碼11種蛋白，其中8種結構蛋白，3種非結構蛋白。此種病毒可感染所有哺乳動物，包括豬、牛、小鼠、地鼠、豚鼠、貓和犬等［1－4］。并且能在人、猴、豚鼠、地鼠、貓、狗、豬和牛的原代腎細胞以及Hela、KB、FL和L細胞等傳代細胞中增殖并引起細胞病變。Reo3也能感染人，能引起兒童腹瀉、呼吸道感染及腦膜炎等疾?。?－6］。由于上述動物和細胞存在Reo3的自然感染，不僅會給動物實驗帶來干擾，而且用上述動物源性材料或細胞生產(chǎn)的人用生物制品也可能存在Reo3的潛在污染，對人用動物源性材料及動物源性生物制品的使用安全造成潛在威脅［7］。

因此建立Reo3 RT-PCR檢測方法，開展對實驗動物和人用動物原材料及動物源性生物制品外源Reo3核酸的檢測。不僅對保證實驗動物的質(zhì)量，而且對保證人用動物源性生物制品原材料及成品的使用安全性至關重要。本文旨在建立簡單、快速、特異、敏感的RT-PCR檢測方法，開展對實驗動物和人用動物源性生物材料及其生物制品Reo3的檢測。

1 材料和方法

1.1 病毒及樣品

呼腸孤病毒3型(Reo3)、小鼠肺炎(PVM)病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎(LCM)病毒、小鼠仙臺病毒(SV)，中國食品藥品檢定研究院實驗動物質(zhì)量檢測室保存。

1.2 主要試劑

RNA快速提取試劑盒購自xygen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Fermentas;dNTP、Taq DNA聚合酶和100 bp DNA marker均購自TaKaRa公司;PCR儀、核酸瓊脂糖凝膠電泳儀、紫外圖像分析系統(tǒng)等

1.3 引物設計及合成

分析已報道的Reo3基因組序列，將不同株M1基因進行比對，根據(jù)GenBank中登陸的Reo3毒株基因序列(序列號:M27261.1)選擇保守區(qū)域作為靶基因，用Primer Premier 5.0軟件設計2組引物:1F:5'-ACTGCTGGAATCGTTCGGAG -3'，1R: 5'-GATGAGATGAGGGGTGCGTA-3'; 2F: 5'-GCTGGCGTTGATTCGTT-3'， 2R: 5'-GGGTCGGCTTCTCCTATT-3'。擴增片斷大小分別為354 bp和431 bp。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 病毒RNA提取

對正常BSC-1細胞、Reo3感染 BSC-1細胞毒、小鼠肺炎(PVM)病毒、小鼠淋巴細胞脈絡叢腦膜炎(LCM)病毒、小鼠仙臺病毒(SV)，按照RNA快速提取試劑盒(xygen)操作方法進行RNA提取。提取后立即進行cDNA的合成，剩余的RNA凍存于－70℃冰箱備用。

1.5 反轉(zhuǎn)錄

通過對隨機引物及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度進行優(yōu)化，確定反轉(zhuǎn)錄體系為:5×RNA PCR Buffer 5 μL、dNTPs Mixture 4 μL、RNase Free dH2O 6 μL、隨機引物 0.5 μL、RNase Inhibitor 1 μL、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL、病毒 RNA 8 μL，反應條件為:42℃孵育 15 min、95℃ 5 min，獲得 cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RT-PCR檢測方法的建立

以獲得的cDNA為模板進行PCR擴增。對2組引物PCR反應體系的 dNTPs濃度、10×Buffer濃度、Taq HS酶濃度、引物、模板量、及反應體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)等進行優(yōu)化，通過對正常BSC-1細胞、Reo3感染 BSC-1細胞毒的進行PCR擴增來確定RT-PCR反應的最佳模式。

1.7 RT-PCR產(chǎn)物的檢測

取5 μL擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)進行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE(0.04 mol/L Tris乙 酸，0.001 mol/L EDTA，pH8.0)，110 V電泳30 min，在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置，以100 bp DNA ladder Marker為參照物，判定結果。RT-PCR陽性擴增片段進行測序，通過與Genbank中Reo3序列進行比對以確定PCR檢測的準確性。

1.8 特異性的試驗

2組引物分別以呼腸孤病毒3型(Reo3)、小鼠肺炎(PVM)病毒、小鼠淋巴細胞脈絡叢腦膜炎(LCM)病毒、小鼠仙臺病毒(SV)和正常BSC-1細胞的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用所建立的PCR方法進行擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

1.9 敏感性的試驗

(1)Reo3細胞毒濃度梯度檢測:

取感染滴度為105.2/mLReo3病毒液，用PBS做系列倍比稀釋，分設 10－1～10－1010個稀釋度。取每個稀釋度病毒液各0.5mL制備模板，用所設計的2組引物分別進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定所能檢測病毒最小滴度。

(2)Reo3 RNA濃度梯度檢測:

將起始濃度為42.4 μg/mL的RNA樣本做倍比稀釋，分設10－1到10－55個濃度梯度進行 RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷所能擴增的最小RNA模板濃度。

1.10 初步應用

1.10.1 對樣品的檢測

對2011年送檢的25只SPF地鼠進行檢測。取25只地鼠腎(編號:1～25號)，經(jīng)過研磨處理后，和正常BSC-1細胞與Reo3細胞毒，同時提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，用引物1 PCR擴增。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

1.10.2 檢測結果驗證

擴增到的陽性樣品進行測序。測序結果經(jīng)BLAST分析，與 GenBank中 Reo3核酸序列進行比對，驗證檢測結果的準確性。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測方法的建立

通過對2組引物PCR反應條件及反應體系的優(yōu)化，確定了PCR最佳反應體系為:10×ExTaqBuffer(Mg2+Free)2.5μL，dNTPs Mixture(10mmol/L)2.5 μL，Taq HS 酶(5U/μL)0.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各 1 μL，cDNA 2.5 μL，補水至 25 μL;PCR最佳反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，共 35 個循環(huán);72℃再延伸5 min。

2.2 RT-PCR產(chǎn)物的檢測

2組引物對Reo3細胞毒分別擴增到長度約為354 bp和431 bp的特異性目的條帶;BSC-1細胞陰性對照均未擴增到特異性目的條帶(結果見圖1)。

從圖1可以看出，雖然2組引物均擴增到特異性目的條帶，但引物2擴增效果不如引物1。

2.3 檢測結果的準確性

選擇引物1與引物2的PCR擴增陽性片段分別進行測序，測序結果經(jīng) BLAST分析，與 GenBank中Reo3核酸序列同源性分別為98%和99%，說明該方法檢測準確性較好。

2.4 特異性驗證

2組引物在以Reo3為模板進行擴增有明顯目的條帶出現(xiàn)，小鼠肺炎(PVM)病毒、小鼠淋巴細胞脈絡叢腦膜炎(LCM)病毒、小鼠仙臺病毒(SV)和及正常BSC-1細胞均無目的條帶(見圖2和圖3)。

圖1 引物1、2 PCR反應條件優(yōu)化結果Fig.1 The results of primer 1，2 PCR reaction conditions optimization

圖3 引物2特異性驗證Fig.3 Specific validation results of primer 2

圖2、圖3說明2組引物PCR檢測方法特異性均較好。

2.5 敏感性試驗

(1)Reo3細胞毒濃度梯度檢測:第1組引物在病毒液稀釋至10－9/mL時，仍可見目的條帶出現(xiàn)(見圖4);第二組引物僅能檢測到病毒液原液濃度。

圖4 引物1RT-PCR檢測敏感性測定——Reo3細胞毒濃度梯度Fig.4 The sceptibility testing results of RT-PCR using primers 1—Cytotoxic concentration gradient of Reo3

由圖4和圖5可知第1組引物較第2組引物敏感性強。

(2)Reo3 RNA濃度梯度檢測:第1組引物在Reo3 RNA模板稀釋至10－5時仍可見目的條帶出現(xiàn)(見圖5)，即所能檢測到的最小RNA模板濃度至少能達到0.42 pg/μL;第2組引物在 Reo3 RNA模板原濃度時，僅隱約可見目的條帶出現(xiàn)。

由上述結果可看出，所建立的RT-PCR方法，在保證了特異性的前提下，靈敏度較高，所能檢出的Reo3最小病毒滴度可達10－9/mL，檢出的最小Reo3 RNA濃度為0.42 pg/μL。綜上比較可得，第1組引物PCR方法的特異性、靈敏度較第2組引物強，適合作為Reo3 RT-PCR檢測方法。

圖5 引物1RT-PCR檢測敏感性測定——Reo3 RNA模板濃度梯度Fig.5 The sceptibility testing results of RT-PCR using primers 1—RNA template concentration gradient of Reo3

2.6 初步應用

2.6.1 利用第1組引物對25只地鼠腎進行檢測:Reo3毒種擴增到長度約354 bp的特異性目的條帶，正常BSC-1細胞和1～25號地鼠腎均無目的條帶出現(xiàn)(見圖6、圖7)。

圖6 利用引物1檢測1～16號地鼠腎電泳結果Fig.6 The electrophoretic results of detection in 1to16 ground mouse kidneys using primers 1

3 討論

Reo3作為人畜共患傳染病在禽類及有經(jīng)濟價值的大動物中，在國內(nèi)外檢測的較多，建立的檢測方法也較多，包括血清學及分子生物學發(fā)方法［1，3，8，9］。但針對實驗動物及人用動物源性材料和人用動物源性生物制品的檢測，目前在我國還是空白。本實驗所建立的Reo3 RT-PCR檢測方法，其目的主要是用于實驗動物及人用動物源性材料和人用動物源性生物制品潛在Reo3的檢測。尤其是一些人用生物制品生產(chǎn)用原材料來源于動物的組織、細胞等，如流行性乙型腦炎(JE)疫苗、麻疹疫苗等。

圖7 利用引物1檢測17～25號地鼠腎電泳結果Fig.7 The electrophoretic results of detected in 17 to 25 ground mouse kidneys using primers 1

本實驗所建立的Reo3 RT-PCR檢測方法，特異性試驗結果顯示，2組引物特異性均較好;通過敏感性實驗比較，可以看出引物1較引物2敏感性強、穩(wěn)定性好。引物1檢測最小病毒滴度可達到Reo3細胞毒原液10－9，與本實驗室建立的免疫熒光檢測方法檢測滴度104.7/mL相比，敏感性要高的多;檢測RNA濃度可達0.42 pg/μL;引物2病毒含量檢測只能達到Reo3細胞毒原液濃度，檢測RNA最小濃度為42.4 μg/mL。因此用引物 1建立的 Reo3 RTPCR檢測方法較用引物2建立的Reo3 RT-PCR檢測方法更適合應用于實驗動物及人用動物源性材料和人用動物源性生物制品的檢測。

本實驗之所以選擇25只地鼠腎用于Reo3的檢測，是因為目前我國乙腦疫苗生產(chǎn)用細胞來源是SPF原代地鼠腎細胞或傳代地鼠腎細胞。而地鼠作為實驗動物應用也很廣泛。25只地鼠腎Reo3病毒檢測均為陰性，與本室 ELISA方法Reo3抗體檢測均為陰性結果相吻合，更保證了檢測結果的準確性和地鼠使用的安全性。

本實驗所建立的RT-PCR檢測方法特異、敏感、可靠，穩(wěn)定性好，檢測的準確性高，可用于實驗動物及人用動物源性材料和人用動物源性生物制品Reo3及其核酸的攜帶或殘留的檢測。為保證實驗動物的質(zhì)量及人用動物源性材料和人用動物源性生物制品的使用安全性提供了可靠依據(jù)。

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Development of A RT-PCR Method for Determination of Mammalian Orthoreovirus 3

WANG Ji，WEI Li，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei
(National Institutes for food and drug Control，National Center for quality of Laboratory Animal，Beijing 100050，China)

Objective To develop a RT-PCR method for determination of Mammalian Orthoreovirus 3(Reo3)in laboratory animal and the biological materials or the biological products for human use from the animal.Methods Two pair of primers specific to the sequences of M1 gene were designed according to the published Mammalian Orthoreovirus 3.With which the RNA of Reo3 was extracted and reversely transcribed to cDNA as a template for PCR amplification.The developed RT-PCR method was optimized，verified for specificity and sensitivity.Results The developed RT-PCR method is good in ensitivity，specificity and stability，and its minimum detection limit using the recombinant plasmid containing Reo3 gene as atemplate was 0.42pg/μL，and the lowest detection virus titer is 10－9/mL.Conclusion The developed RT-PCR method can be used in detecting the Mammalian Orthoreovirus 3(Reo3)in laboratory animaland the biological materials or the biological products for human use from the animal.

Mammalian Orthoreovirus 3;RT-PCR;Laboratory animal;Biological materials and the biological products for human use

Q781;R33

A

1671-7856(2012)09-0046-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.010

2012-08-24

“國家科技支撐計劃”疫苗類生物制品安全性評價技術研究(2008BAI54B01)。

王吉(1974－)，女，副研究員，研究方向:微生物學和免疫學。

賀爭鳴(1957－)，男，研究員，博士，研究方向:微生物學和免疫學。E-mail:zhengminghe57@163.com。