楊鳳梅，李艷艷，魯帥堯，趙 遠，禹文海，陳麗雄，王俊斌，和占龍

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118)

實驗性高脂血癥恒河猴模型的初步建立及分析

楊鳳梅，李艷艷，魯帥堯，趙 遠，禹文海，陳麗雄，王俊斌，和占龍

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118)

目的 建立實驗性高脂血癥恒河猴模型，為人類高脂血癥研究提供理想動物模型。方法 設計高脂實驗飼料配方并檢測常規(guī)營養(yǎng)成分，用高脂飼料誘導實驗性高脂血癥恒河猴模型，分別在2個月、4個月、6個月后監(jiān)測體重、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL－C)、低密度脂蛋白(LDL－C)等指標，對其血脂指標的變化趨勢進行分析。結果 模型組在實驗2個月、4個月時的日采食量和攝入能量均低于對照組(P＜0.05)，但體重則無明顯變化(P＞0.05);而在實驗6個月時日采食量和攝入能量與對照組無顯著性差異(P＞0.05)，體重有顯著性差異(P＜0.05);模型組與對照組的 TC、TG、HDL－C、LDL－C在實驗前和2個月比較無顯著性差異(P＞0.05);在4個月比較時TC、TG、LDL－C有顯著性差異(P＜0.05)，而HDL無顯著性差異(P＞0.05);在6個月比較時 TC、LDL－C有顯著性差異(P＜0.05)，并且 TC、LDL－C遠遠高于恒河猴血脂的正常參考值水平，而 TG、HDL－C則無顯著性差異(P＞0.05);變化趨勢分析結果為，模型組 TC和 LDL－C水平有遞增趨勢、TG水平則出現(xiàn)了先遞減后逐漸恢復的趨勢、HDL－C水平未出現(xiàn)明顯變化趨勢。結論 模型組恒河猴具有高膽固醇血癥和高低密度脂蛋白血癥的特征，已經(jīng)初步建立了實驗性恒河猴高脂血癥動物模型。

血脂;高脂血癥;模型，動物;恒河猴

隨著人類生活水平的日益提高，高脂血癥的發(fā)病率也逐年增加，相關的醫(yī)學研究表明動脈粥樣硬化是導致心腦血管疾病的主要病理因素，而血脂代謝紊亂導致的高脂血癥又是動脈粥樣硬化重要的危險因素，可見高脂血癥是腦卒中、冠心病、心肌梗死、猝死等心腦血管疾病的危險因素。因此，闡明高脂血癥的發(fā)病機制，探索高脂血癥的有效預防與治療對其相關疾病的研究和控制具有重要意義。高脂血癥動物模型不僅是研究人類高脂血癥發(fā)病機理的有效工具，也是開展脂代謝異常及動脈粥樣硬化研究的重要的手段。目前，用于高脂血癥動物模型研究的實驗動物主要有兔、大鼠、小鼠等，采用與人類遺傳和生理生化指標都較為接近的恒河猴作為模型的在國內(nèi)還未見報道［1－4］。因此，本實驗選用恒河猴作為實驗動物，用高脂飼料飲食誘導方法，初步建立實驗性高脂血癥恒河猴模型并對其血脂指標變化趨勢進行分析，為人類高脂血癥的研究提供理想動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗恒河猴來源于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所醫(yī)學靈長類研究中心，普通級恒河猴實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滇)2010－0006;實驗過程在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所動物實驗設施中進行，實驗動物使用許可證號為:SYXK(滇)2010－0009，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 儀器設備

移液器 (eppendorf 100 μL)、離心機 (Thermo LEGEND MICRO 21R)、羅氏全自動生化分析儀(P800)。

1.3 方法

1.3.1 實驗飼料的設計與制作:實驗組模型飼料的設計以高脂、高熱量為特點，使用特殊預混料;因高脂導致飼料較難形成顆粒，通過特殊的加工工藝制作為顆粒飼料，以正常猴群飼料作為對照組，配方見表1，兩種飼料的常規(guī)營養(yǎng)成分見表2。

1.3.2 動物分組及高脂血癥模型的誘導:隨機挑選正常飼養(yǎng)的成年8歲健康恒河猴共16只，分為兩組每組8只，雌雄各半，分別為模型組和對照組。模型組飼喂模型飼料，對照組飼喂正常飼料，自由采食與飲水，測定日采食量和攝入能量，根據(jù)恒河猴體型大、善于運動、代謝旺盛等生理特點，本次實驗以每兩個月測定一次體重、血脂等指標進行監(jiān)測。

表1 模型飼料與正常飼料的配方(%)Tab.1 Formulation of model feed and natural feed(%)

表2 模型飼料和正常飼料的常規(guī)營養(yǎng)成分Tab.2 Seven general nutrients of model feed and natural feed

1.3.3 血清樣品采集:試驗動物空腹12h以上，進行后肢靜脈采血2mL，分裝在一次性自動定量采血管中，3000r/min離心 30min，收集血清，標記后－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血脂檢測:使用羅氏全自動生化分析儀(P800)檢測血清樣品，TC、TG采用氧化酶法測定，HDL－C、LDL－C 采用直接法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 模型組和對照組在實驗期間的日采食量及日攝入能量的測定結果(見表3)。測定結果表明，在實驗2個月、4個月對照組恒河猴的日采食量和攝入能量均高于模型組(P＜0.05)，這應該是高脂飼料適口性較差以及油膩食物限制進食量等原因造成的結果，而在6個月時，模型組恒河猴的日采食量和攝入能量與對照組在統(tǒng)計學上無顯著性差異(P＞0.05)。

表3 恒河猴高脂血癥模型組和對照組在試驗期的日采食量及攝入能量測定結果Tab.3 Feed intake and Energy intake of the model group and the control group in experiment

2.2 模型組和對照組在實驗期間的體重監(jiān)測結果(見表4)，體重監(jiān)測結果顯示，在實驗前、2個月、4個月時，模型組與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)，而在6個月時有顯著性差異(P＜0.05)。

表4 恒河猴高脂血癥模型組和對照組體重監(jiān)測結果(kg)Tab.4 Weight of the model group and the control group(kg)

2.3 模型組和對照組在實驗期間的血脂四項(TC、TG、HDL－C、LDL－C)的監(jiān)測結果(見表5)，結果表明模型組與對照組的 TC、TG、HDL－C、LDL－C 在實驗前和2個月比較無顯著性差異(P＞0.05)，在4個月比較時 TC、TG、LDL－C 有顯著性差異(P ＜0.05)，而HDL－C沒有顯著性差異(P＞0.05);模型組實驗前和4個月時比較 TC、LDL－C呈顯著上升(P＜0.05)，而TG則顯著下降(P＜0.05);在6個月比較時 TC、LDL－C 有顯著性差異(P ＜0.05)，并且 TC、LDL－C遠遠高于恒河猴血脂的正常參考值水平，而TG、HDL－C 則無顯著性差異(P ＞0.05)。

表5 恒河猴高脂血癥模型組和對照組血脂四項監(jiān)測結果Tab.5 Four indexes about lipids of the model group and the control group

2.4 血脂各項指標的分析結果表明，在實驗過程中對照組血清 TC、TG、HDL－C、LDL－C 水平均無明顯變化，模型組TC水平有遞增趨勢，并在4個月、6個月時顯著增高(P＜0.05)(見圖1)，具備了高膽固醇血癥的特征;而TG水平在模型組則出現(xiàn)了先遞減后逐漸恢復的趨勢，在4個月時顯著降低(P＜0.05)，在6個月時又恢復(見圖2)，這可能與受試動物膽固醇的攝入和日攝入能量的水平有關，具體機制尚未清楚;HDL－C水平在模型組未出現(xiàn)明顯變化(見圖3);LDL－C水平在模型組也有遞增趨勢，并在4個月、6個月時顯著增高(P＜0.05)(見圖4)，提示脂代謝紊亂導致了高脂血癥。

圖1 血清TC變化趨勢分析Fig.1 Analysis of mutative trend of TC

圖2 血清TG變化趨勢分析Fig.2 Analysis of mutative trend of TG

圖3 血清 HD{L－C變化趨勢分析Fig.3 Analysis of mutative trend of HDL－C

圖4 血清LDL－C變化趨勢分析Fig.4 Analysis of mutative trend of LDL－C

3 討論

恒河猴是與人類在進化親緣關系上僅次于黑猩猩的靈長類動物，具有與人類基因同源性高、免疫反應與人相似等優(yōu)點，廣泛應用于生物醫(yī)學研究的各個領域。因此，本實驗采用恒河猴作為高脂血癥的模型動物在實驗研究中有獨特優(yōu)勢之處。本實驗結果表明，采用高脂飼料誘導高脂血癥動恒河猴型的過程中，在實驗2個月、4個月時模型組的日采食量和日攝入能量均低于對照組，加之本實驗所采用的實驗猴是生長和代謝都較為穩(wěn)定的成年猴，導致了試驗猴的體重均無明顯變化，但在實驗6個月時，隨著采食量與日攝入量的增加，體重也隨之增加。在實驗 4個月、6個月時模型組血清 TC、LDL－C明顯高于對照組(P＜0.05)，并穩(wěn)定維持在一個較高的水平，而 HDL－C無明顯變化，這一結果與趙金明等［6］報道的觀點相一致;而在4個月時血清TG并未升高，反而明顯低于對照組，這與王靜鳳［7］、劉小美［8］、林衛(wèi)華［9］報道的結果一致。造成這些結果的可能機制是高脂肪和高TC的攝入使動物體內(nèi)血液的 TC含量劇增，出現(xiàn) TC代謝障礙，進而引起機體的血脂代謝紊亂，直接導致LDL－C的代謝障礙并在體內(nèi)蓄積，從而出現(xiàn)了高TC血癥和高LDL－C血癥。而實驗前期實驗組恒河猴血清TG明顯降低，可能的機制是TC在體內(nèi)劇增后促進了肝臟 TG合成，并通過降低β－氧化反應，抑制肝臟脂肪酸代謝和減少肝臟TG向血液分泌，導致血液中TG濃度降低［10］;同時因前期高脂飼料組的恒河猴日攝入能量低于對照組，未在體內(nèi)形成能力蓄積增加體內(nèi)TG的合成，反而部分地增加了能量的代謝;在6個月時，模型組血清TG已逐漸恢復到正常水平，這可能是隨著時間的推移，模型組恒河猴已適應高脂飼料，導致日進食量與日攝入能量的上升，所以血清TG逐漸恢復。

本實驗結果說明，采用高脂飼料建立的恒河猴高脂血癥動物模型前期表現(xiàn)為血清TC、LDL－C明顯升高，血清TG先降后又逐漸恢復。根據(jù)高脂血癥在臨床上的分類，用高脂飼料建立的恒河猴高脂血癥動物模型符合高 TC血癥和高 HDL－C血癥的特征［10－12］，模型構建基本成功。通過各項指標分析，本次實驗已經(jīng)初步建立了實驗性恒河猴高脂血癥動物模型，可為人類部分高脂血癥研究提供理想動物模型。同時將延長高脂飲食誘導動物模型的試驗周期，觀察隨著時間的延長受試動物是否會逐步適應高脂飼料而增加采食量和攝入能量，并觀察體重的變化趨勢;同時觀察TG的變化趨勢和逆轉(zhuǎn)點，是否會產(chǎn)生混合型高脂血癥、高甘油三酯血癥、低高密度脂蛋白血癥等，結果將在后續(xù)的試驗中作逐一報道。

［1］鐘民濤，黃敏，盧靜，等.長爪沙鼠速發(fā)型高脂血癥模型的初步建立［J］.中國實驗動物學報，2006，14(3):217－221.

［2］吳韞宏，方顯明.家兔實驗性高脂血癥模型的研究［J］.廣西中醫(yī)學院學報，2004，7(2):1－2.

［3］李金蓮，高南南，楊潤梅.豚鼠高脂血癥模型的建立及機制探討［J］.中國實驗動物學報，2009，17(2):115－119.

［4］謝忠忱，黃廣勇，陳華，等.五指山小型豬高脂血癥模型的建立［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2006，16(9):537－540.

［5］沈果，田軍東，郭相保，等.野生太行山獼猴血液生理生化指標測定與分析［J］.四川動物，2011，(2):254－257.

［6］趙金明，朱競赫，陳 賀，等.不同配方高脂乳劑大鼠高脂血癥模型的研究［J］.中藥藥理與臨床，2012，28(1):177－180.

［7］王靜鳳，逄龍，王玉明，等.兩種海參對實驗性高脂血癥大鼠治療作用的比較研究［J］.中國海洋大學學報，2007，37(4):597－600.

［8］劉小美，方肇勤，潘志強，等.兩種配方高脂飼料致高脂血癥大鼠的證候比較［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2008，27(2):33－37.

［9］林衛(wèi)華，鄭定仙，馮丁山，等.大鼠實驗性高脂血癥模型分析［J］.中國熱帶醫(yī)學，2010，10(3):324－325.

［10］Liu CH，Huang MT，Huang PC.Sources of Triacylglycerol Accumulation in Livers of Rats Fed a Cholesterol Supplemented Diet［J］.Lipids，1995，30:527－531.

［11］FernandezmL.Guineapigsasmodelsforcholesteroland lipoprotein metabolism［J］.J Nutrition，2001，131:10－20.

［12］Vander Hooqt CC，de Haan W，Westerp M，et al.Fenof ibrate in creases HDL－cholesterol by reducing cholesteryl ester transfer protein expression［J］.J Lipid Res，2007，48(8):1763－1771.

Establishment and Analysis of Experimental Hyperlipidemia Model in Rhesus Monkey

YANG Feng－mei，LI Yan－yan，LU Shuai－yao，ZHAO Yuan，YU Wen－h(huán)ai，CHEN Li－xiong，WANG Jun－bing，HE Zhan－long
(Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases，Kunming，650118，China)

Objective To establish Rhesus monkey model of hyperlipidemia to provide reliable animal model for the study of human hyperlipidemia.Methods Designed high fat experimental feed formulations and detected its nutrients to feed Rhesus monkey to arouse hyperlipidemias.2 mouths、4 mouths、6mouths later，we monitored the body weight，serum total cholesterol(TC)，triglyceride(TG)，high－density lipoprotein cholesterol(HDL－C)，low density lipoprotein cholesterol(LDL－C)，and analyzed the trend of each index above.Results When it was 2 moths and 4 months later，the feed intake and energy intake of model group were lower than control group(P＜0.05)，but the body weight of model group was not significantly different from that of the control group(P ＞ 0.05);When it was 6 moths，the feed intake and energy intake of model group was not significantly different from that of the control group，and the body weight of model group were significantly different from that of the control group(P ＜0.05);When it was 2 moths later，the indexes of TC，TG，HDL－Cand LDL－C of the model group were not significantly different from that of the control group(P ＞ 0.05).When it was 4 moths later，the indexes of TC，TG，LDL－C of the model group were significantly different from that of the control group(P ＜0.05).When it was 6 moths later，the indexes of TC，LDL－C of the model group were significantly different from that of the control group(P ＜ 0.05)，and much higher than the normal levels，but the indexes of TG，HDL－C were not significantly different from that of the control group(P ＞ 0.05).According to the monitoring，TC and LDL－C showed a increase trend，TG showed a gradual recovery after the first descending trend，and the HDL－C was not significantly changed.Conclusion Rhesus monkeys of the model group has a feature of high cholesterol and high low－density lipoprotein cholesterol.The paper has initialy established Rhesus monkey model of experimental hyperlipidemia.

Lipid;Hyperlipidemia;Model，animal;Rhesus monkey

R589.2;R332

A

1671－7856(2012)09－0031－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.007

2012－08－25

云南省技術創(chuàng)新人才培養(yǎng)基金(2009CI117);云南省應用基礎研究面上項目資助課題(2009ZC185M)。

楊鳳梅(1982－)，女，研究實習員，碩士，從事實驗動物學研究，E－mail:yangfengmeihei@126.com。

和占龍(1972－)，男，副研究員，碩士，碩士生導師，從事實驗動物學研究，E－mail:hzl@imbcams.com.cn。