鄭笑笑，魏 蘋，趙麗娜，王世貴，黨向利，張秋伶，唐 斌

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036；2.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州325005；3.北京市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校平谷分校，北京101200）

甜菜夜蛾P(guān)450基因的克隆及組織特異性分析

鄭笑笑1，魏 蘋1，趙麗娜1，王世貴1，黨向利2，張秋伶3，唐 斌1

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036；2.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江溫州325005；3.北京市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校平谷分校，北京101200）

為獲得甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）P450基因序列并分析其分布的組織特異性，采用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù)克隆得到了該基因的cDNA全序列：全長2 565 bp，包含1 010 bp的3′非編碼區(qū)域和42 bp的5’非編碼區(qū)域，開放閱讀框（ORF）長1 515 bp，編碼504個氨基酸，分子量為57.74 kD，理論等電點為8.01；包含2個糖基化位點，2～21 aa為跨膜結(jié)構(gòu).同源比對結(jié)果表明，SeP450與其它昆蟲的P450基因擁有同樣的2個保守結(jié)構(gòu)域：CAFG、AG＼ET.SeP450與棉鈴蟲蛾Helicoverpa armigera P 450同源性最高，達74%；系統(tǒng)發(fā)育分析也表明二者親緣關(guān)系較近.同時RT－PCR結(jié)果顯示SeP450mRNA在中腸、脂肪體等多種組織中都有表達，其中中腸表達量最高.

甜菜夜蛾；細胞色素P450；基因克隆；序列分析

細胞色素P450廣泛分布于不同生物中，從原始的細菌到高度發(fā)達的哺乳類體內(nèi)均有，并參與多種代謝反應(yīng)［1］.P450酶系是一類分子量在46～60 k Da［2］的蛋白質(zhì)，它們的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類似［3］.研究發(fā)現(xiàn)，來源于不同種或同種不同品系、甚至是同一品系不同組織的P450，其在分子量、光譜特征、分布特征、免疫性質(zhì)、氨基酸序列、調(diào)控機制及底物專一性等方面都是不盡相同的［4］，這種多樣性使生物對多種多樣的物質(zhì)都具有代謝能力，也是P450基因?qū)ι矬w整個生命活動重要性的體現(xiàn)［5］.歸根結(jié)底，細胞色素P450擁有多樣性的根本原因是其基因結(jié)構(gòu)的多樣性，而這種結(jié)構(gòu)的多樣性已從成功克隆測序的P450基因中得到證實［6］.同時，研究發(fā)現(xiàn)，除少數(shù)特例外，每一P450基因總是產(chǎn)生單一的P450蛋白.P450蛋白質(zhì)種類的多樣性及其底物的重疊性使P450酶系可以催化多種類型的反應(yīng)，例如對許多外來物質(zhì)如殺蟲劑及其他環(huán)境有毒物質(zhì)具有代謝作用［7］，這也是昆蟲具有對殺蟲劑的抗藥性及對植物有毒物質(zhì)耐受性的主要原因.同時P450蛋白質(zhì)還參與一些起重要生理功能的內(nèi)源性物質(zhì)的代謝［8］，如參與昆蟲體內(nèi)激素的合成和代謝等［9］.P450分布的廣泛性、催化機制和基因表達調(diào)控機制的多樣性都體現(xiàn)出其強大的生物學(xué)重要性，因此可以預(yù)見P450的研究及應(yīng)用勢必會具有十分廣闊的前景和意義［10］.

甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）是一種世界性頑固害蟲，主要危害蔥、豇豆、蕹菜、蘿卜、白菜、萵筍、甘藍、四季豆等作物，以百合科蔥類危害損失最重［11］.本文從甜菜夜蛾P(guān)450基因的克隆入手，并對其表達特性加以分析，以期為深入研究分析其功能及探討更加準確有效的農(nóng)業(yè)害蟲防治技術(shù)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 甜菜夜蛾的飼養(yǎng)與材料收集 甜菜夜蛾由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院饋贈，在（26±1）℃、14 L∶10 D條件下室內(nèi)連續(xù)多代飼養(yǎng)后作為試驗材料.大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株由杭州師范大學(xué)動物適應(yīng)與進化杭州市重點之重實驗室保存.甜菜夜蛾成蟲的解剖在冰上進行，解剖鏡下觀察并分離脂肪體等組織，分離放置于EP管后，迅速轉(zhuǎn)移到－80℃中保存?zhèn)溆?

1.1.2 主要試劑 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit、AMV RTase反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶和p MD18－T載體均購自寶生物工程（大連）公司；DNA純化回收試劑盒購自O(shè)mega公司.

1.1.3 引物序列 根據(jù)已知昆蟲P450基因cDNA序列的保守結(jié)構(gòu)域，采用多重序列在線比對軟件（http：／／multalin.toulouse.inra.fr／multalin／multalin.html）設(shè)計2對特異性引物：SeP450－3F1、SeP450－3F2和SeP450－3R1、SeP450－3R2，分別用于擴增甜菜夜蛾P(guān)450基因的5′和3′端序列.再根據(jù)2對引物獲得的末端片段序列設(shè)計探針引物：SeP450－PFA，SeP450－PFB和SeP450－PFC（表1）.引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成.

表1 P450基因cDNA擴增的引物序列Tab.1 Cloning primers for P450 cDNA

1.2 甜菜夜蛾總RNA的抽提

采用異硫氰酸胍法抽提甜菜夜蛾脂肪體等組織的總RNA.將100 mg新鮮的脂肪體組織放入小勻漿器中，加入500μL變性溶液D（4 mol·L－1異硫氰酸鈉、25 mmol·L－1檸檬酸鈉、0.1 mol·L－1巰基乙醇、0.5%十二烷基肌氨酸鈉）充分勻漿；勻漿后轉(zhuǎn)移至DEPC處理過的EP管中，加入50μL 2 mol·L－1乙酸鈉溶液（p H4.0）、500μL p H7.0的飽和平衡酚和100μL氯仿／異丙醇（V（氯仿）∶V（異丙醇）＝49∶1）混合液，顛倒混勻；冰上放置15 min后，4℃12 000 r／min離心20 min；取上層水相至新的EP管中，加入等體積異丙醇混勻，－20℃放置1 h以上，4℃12 000 r／min離心15 min；沉淀重溶于100μL變性溶液D中，另加入10μL p H4.0的乙酸鈉溶液和300μL乙醇混勻，－20℃放置1 h以上；4℃12 000 r／min離心15 min，將沉淀重溶于30～50μL的DEPC處理水中，－80℃冰箱長期保存.

1.3 cDNA的末端快速擴增（RACE）

根據(jù)Clontech公司（大連寶生物有限公司）的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書，分別合成用于5′和3′－RACE擴增的cDNA.5′－RACE擴增采用試劑盒中的UPM通用引物和SeP450－5R1，巢式PCR時采用NUP和SeP450－5R2；3′－RACE擴增采用試劑盒中的UPM引物和SeP450－3F1，巢式PCR時采用NUP和SeP450－3F2.PCR擴增程序為：94℃10 min；94℃30 s，48℃30 s，72℃90 s，30個循環(huán).SeP450－5R2和SeP450－3F2分別用于5′和3′－RACE的菌落PCR驗證.

1.4 PCR產(chǎn)物的純化及序列分析

在甜菜夜蛾P(guān)450基因的克隆中，利用巢式PCR引物SeP450－3F2和NUP及SeP450－5R2和NUP進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測分別獲得了長約1 200 bp和2 000 bp大小的條帶，將目的條帶采用瓊脂糖凝膠電泳回收后，連接到p MD18－T載體中，將其轉(zhuǎn)入DH5α細胞，將驗證后正確的轉(zhuǎn)化子送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序.序列分析和系統(tǒng)分析分別采用Dnastar、Vector、Compute pI／Mw、Clustal W和MEGA3.1等分析軟件.

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜夜蛾P(guān)450基因的克隆和序列分析

將測序獲得的2 565 bp基因片段翻譯成氨基酸序列，并利用NCBI在線生物學(xué)軟件BlastP對該序列進行同源性分析.結(jié)果顯示，與鱗翅目昆蟲的P450具有較高的同源性且與棉鈴蟲Helicoverpa armigera的同源性最高（74%），表明該基因為P450家族基因.根據(jù)該基因序列，分別在5′和3′端設(shè)計了2條特異性引物，PCR擴增獲得了甜菜夜蛾P(guān)450基因的cDNA序列（GenBank登錄號EJ524855），命名為Proex P450.該基因全長為2 565 bp，其ORF為1 515 bp，編碼504個氨基酸，軟件（http：／／expasy.org／tools／pi＿tool.html）分析并預(yù)測出該基因編碼蛋白的分子量為57.74 k D，等電點為8.01.采用TMHMM Server 2.0和SignalP 3.0 Server在線分析，發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)為2～21 aa之間，未發(fā)現(xiàn)信號肽序列.采用NetNGlyc分析發(fā)現(xiàn)ProexP450蛋白擁有2個N－糖基化位點，分別位于203～204 aa之間和250～251 aa之間（見圖1）.

圖1 甜菜夜蛾P(guān)450基因的核甘酸和氨基酸序列分析Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of P450 from S.exigua

2.2 昆蟲的P450基因同源性和進化分析

查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，并將已報道和登錄的昆蟲P450蛋白序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)昆蟲的P450家族擁有2個非常保守的結(jié)構(gòu)域：CAFG、AG＼ET.從不同目的昆蟲中挑選代表性物種，用Multiple在線軟件比對分析后發(fā)現(xiàn)，昆蟲的P450蛋白不是特別保守，同源性在不同物種間差異很大（見圖2）.

圖2 不同目昆蟲P450基因編碼蛋白序列的比對Fig.2 Alignment of the deduced amino acid sequences of P450 gene in insects

甜菜夜蛾與其它昆蟲P450蛋白序列的同源性結(jié)果如下：棉鈴蟲蛾H.armigera（AY950636）74%、玉米夜蛾H.zea（AF285830）72%、煙芽夜蛾H.virescens（AF140279）70%、野桑蠶B.mandarina（DQ252325）56%、家蠶B.mori（NM＿001112755）55%、意大利蜜蜂A.mellifera（NM＿001040234）38%、德國小鐮B.germanica（AF281328）35%、麗蠅蛹集金小蜂N.vitripennis（XM＿001600233）36%、加拿大鳳蝶P.canadensis（AF278603）54%、果蠅D.willistoni（XM＿002063174）36%、果蠅D.simulans（XM＿002080296）36%、黑腹果蠅D.melanogaster（NM＿078904）36%、果蠅D.sechellia（XM＿002032611）36%、果蠅D.yakuba（XM＿002089342）35%、岡比亞按蚊A.gambiae（AY193729）35%、豌豆蚜A.pisum（XM＿001944564）36%、赤擬谷盜T.castaneum（XM＿961344）33%、馬鈴薯甲蟲L.decemlineata（DQ117463）35%、致倦庫蚊C.quinquefasciatus（XM＿001847355）34%、埃及伊蚊A.aegypti（XM＿001653637）34%、北美黑鳳蝶P.polyxenes（DQ365698）52%和北美黑條黃鳳蝶P.glaucus（AF280615）53%.由上可知，在P450蛋白家族中，甜菜夜蛾與鱗翅目棉鈴蟲蛾的同源性最高（74%），與鞘翅目赤擬谷盜的同源性最低（33%）.

將已報道或登錄的昆蟲P450的蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果如圖3所示.

圖3 甜菜夜蛾P(guān)450基因與相關(guān)蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.3 System evolution analysis of P450 from S.exigua and other related proteins

可見在系統(tǒng)進化上，P450家族能很好地區(qū)分昆蟲的不同分類階元：鱗翅目與膜翅目、虱目的遺傳距離較近，其次為雙翅目和鞘翅目.昆蟲包含了4個P450基因家族，分屬于CYP4、CYP6、CYP9和CYP18家族，本次克隆獲得的為CYP6B，屬于CYP6家族.

2.3 甜菜夜蛾P(guān)450基因的組織分布

RT－PCR結(jié)果顯示SeP450基因m RNA在腦、表皮、脂肪體、中腸、馬氏管、卵巢、氣管中均有表達，且主要分布在脂肪體、中腸和馬氏管中，其中中腸含量最高（見圖4）.

圖4 甜菜夜蛾P(guān)450基因的組織分布Fig.4 Tissue distribution of SeP450 from S.exigua

3 討 論

細胞色素P450于1958年被發(fā)現(xiàn)，由于其分布的廣泛性、結(jié)構(gòu)的多樣性、功能的復(fù)雜性及基因的多層次調(diào)控性，一直受到人們的廣泛重視.P450酶系在昆蟲的生長、發(fā)育、取食等過程中起著十分重要的作用.但由于昆蟲P450本身的特點，用生物化學(xué)方法來研究昆蟲P450的結(jié)構(gòu)和功能受到了一定的限制［1，6］.1982年Fujii－Kuriyama等克隆并測序得到肝的P450基因之后，P450基因的克隆及序列分析、影響其分布和合成的因素等成為研究的熱點［12］.近代研究的一個主要焦點便是昆蟲P450種類在異生化合物的解毒功能中所起的作用［13］.越來越多的昆蟲P450基因被克隆和研究利用.

20世紀60年代，P450酶系因其在昆蟲抗藥性及昆蟲對寄主植物適應(yīng)性中的作用而受到重視.目前，NCBI中已有不少昆蟲的P450基因序列，如鞘翅目的赤擬谷盜［14］，鱗翅目的家蠶［15］，雙翅目的埃及伊蚊［16］、黑腹果蠅［17］，膜翅目的意大利蜜蜂［18］、麗蠅蛹集金小蜂［19］，虱目的人虱［20］等.至今有關(guān)昆蟲P450酶系的研究已深入到分子水平［21］.昆蟲的第一個P450c DNA是由Snyder和Davidson分離的，被定名為CYP4E1［22］.至今已鑒定的昆蟲P450基因分屬于8個基因家族（CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP15，CYP18，CYP28，CYP48），新的基因也還在被不斷研究發(fā)現(xiàn).P450基因不僅基因總數(shù)十分龐大，而且同一種生物中就存在多種，例如按蚊至少有17種［23］、果蠅有14種［24］.

為了研究和探討P450在甜菜夜蛾的發(fā)育和解毒方面的作用，本研究首先以甜菜夜蛾脂肪體總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，PCR擴增獲得其基因的全長cDNA序列，利用生物學(xué)軟件對其與其他物種的同源性進行了分析.此外，還采用RT－PCR對該基因的組織分布特異性進行了研究.細胞色素P450雖然在許多組織或器官中存在，但其分布具有一定的特異性：主要分布在外源化合物進入體內(nèi)所經(jīng)過的主要入口的一些組織中，這些組織是針對經(jīng)口皮進入的外源化合物的第一道防線.如在哺乳動物中，它主要分布于肺、皮膚、腸道、肝臟，這些都是氧化作用的重要場所；在魚類中，主要分布于腎、肺和鰓；在昆蟲中，主要分布于中腸、馬氏管和脂肪體，而且中腸中的含量最高［25］.本研究結(jié)果與此一致.可見P450分布的特異性使其可以最大限度、最有效地發(fā)揮其生物學(xué)功能［26］.

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Cloning and Sequence Characteristics Analysis of P450 Gene from Spodoptera exigua（Lepidoptera：Noctuidae）

ZHENG Xiao－xiao1，WEI Ping1，ZHAO Li－na1，WANG Shi－gui1，DANG Xiang－li2，ZHANG Qiu－ling2，TANG Bin1
（1.College of Life and Environmental Science，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China；2.Zhejiang Institute of Subtropical Crops，Wenzhou 325005，China；3.Beijing agricultural radio and television school pinggu branch，Beijing 101200，China）

In order to obtain P450 gene sequence in Spodoptera exigua and analyze the tissue distribution，homology coloning and RACE were adopted to colone the cDNA of Spodoptera exigua P 450.The full length of cDNA with calculated molecular mass of 57.74 k D and pI of 8.01 is 2 565 bp，which includes an ORF of 1 515 nucleotides that encodes 504 amino acid residues and a 42 or 1 010 nucleotide for 5′－or 3′－non－coding region respectively.It has two glycosylation sites，the 2～21 aa is transmembrane structure.Homologous comparison results indicate that SeP450 contains two conservative domains the same as the P450 gene in other insects，including CAFG and AG＼ET.SeP450 shares 74%identity with that of Helicoverpa armigera，which is the highest and the phylogenetic analysis shows that the two species are most closely related.The result of RT－PCR show that SeP450 mRNA is expressed in midgut，fat body and other tissues，with the highest expression level in the midgut.

Spodoptera exigua；cytochrome P450；gene cloning；sequence analysis

S476.2；Q781

A

1674－232X（2012）03－0198－07

10.3969／j.issn.1674－232X.2012.03.002

2011－12－13

國家自然科學(xué)基金項目（31000880）；浙江省重點科技創(chuàng)新團隊項目（2010R50039）；浙江省自然科學(xué)基金項目（Y3100176）；浙江省教育廳科研計劃項目（Y201019137）；杭州師范大學(xué)優(yōu)秀中青年教師支持計劃項目（JTAS2011－01－031）；杭州師范大學(xué)生物科學(xué)國家特色專業(yè)本科生科技創(chuàng)新項目.

唐 斌（1980—），男，副研究員，博士，主要從事昆蟲分子生物學(xué)和害蟲生物防治相關(guān)領(lǐng)域研究.E－mail：tbzm611＠163.com