范璐璐

睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliaryneurotrophic factor receptor,CNTF）最初是從雞胚眼提取物中分離出的一種在能在體外促進(jìn)雞胚睫狀神經(jīng)元存活的蛋白質(zhì)。最近有作者采用熒光金(Fluoro-gold) 標(biāo)記RGCs的方法證實(shí)，在眾多因子中，CNTF是唯一能有效促進(jìn)成年倉鼠RGCs再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子[1]。當(dāng)視神經(jīng)受損傷時(shí)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體 alpha(ciliaryneurotrophic factor receptor alpha,CNTFRα)從細(xì)胞膜上釋放，以可溶形式與 CNTF共同反向運(yùn)輸?shù)绞軗p部位，發(fā)揮其保護(hù)作用[2]。在發(fā)育成熟的視網(wǎng)膜中，CNTF主要在節(jié)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，當(dāng)視網(wǎng)膜受到機(jī)械或光損傷、缺血或視神經(jīng)橫斷傷后，不僅節(jié)細(xì)胞內(nèi)的 CNTF表達(dá)明顯增加，在視網(wǎng)膜各層也出現(xiàn)明顯的 CNTF表達(dá)[3]。本實(shí)驗(yàn)利用兔慢性高眼壓模型，通過免疫組織化學(xué)檢測方法探討了兔慢性高眼壓損傷后視網(wǎng)膜中CNTF及CNTFRα的表達(dá)定位變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康新西蘭大白兔40只，體重2.5～3Kg，雌雄不限。采用電凝器電凝兔雙眼鞏膜表面至少三組靜脈以及角膜緣周圍血管建立慢性高眼壓模型,以眼壓升高＞22mmHg,并能持續(xù)1周為誘發(fā)慢性高眼壓成功[4]。選取造模成功的24只（48眼）兔慢性高眼壓眼，隨機(jī)分為4組慢性高眼壓模型組，每組6只兔（12眼），分別觀察7、14、21、28d。另取正常兔6只（12眼）只剪開其球結(jié)膜作為假手術(shù)對(duì)照組（簡稱對(duì)照組）。

1.2 慢性高眼壓動(dòng)物模型的建立

速眠新 0.1ml/kg兔耳緣靜脈注射行全身麻醉，沿角膜緣剪開球結(jié)膜 270°,分離并暴露鞏膜表面靜脈,電凝器電凝雙眼鞏膜表面至少三組靜脈以及角膜緣周圍血管,高頻電凝功率為20～50mw,時(shí)間為5s，直至血管組織發(fā)白,血流阻斷。對(duì)照組只剪開球結(jié)膜，未進(jìn)行鞏膜表面靜脈以及角膜緣周圍血管電凝。兔雙眼眼壓測量使用schiotz眼壓計(jì),根據(jù)造模成功標(biāo)準(zhǔn)排除術(shù)后眼壓升高不理想個(gè)體。

1.3 組織取材與切片

動(dòng)物到達(dá)存活時(shí)間點(diǎn)后，用速眠新注射液(0.3～0.8ml/kg)肌肉注射麻醉動(dòng)物后，迅速摘除眼球，立即置于PFA液中固定(固定12小時(shí)后剪開角膜去除晶狀體和玻璃體繼續(xù)固定12小時(shí))。取視乳頭正下方(6點(diǎn)位)1㎜處4㎜×6㎜大小的視網(wǎng)膜組織，用伊紅標(biāo)記取好的視網(wǎng)膜組織的近視乳頭側(cè)。沖洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟定位包埋。將包埋好的視網(wǎng)膜標(biāo)本沿近視乳頭側(cè)向遠(yuǎn)視乳頭側(cè)連續(xù)切片，片厚4μm，每一標(biāo)本切片5～8張。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色—辣根過氧化物酶–鏈酶卵白素（Streptavidin/Peroxidase，S-P）法，具體步驟如下：①切片常規(guī)脫蠟至水；②新鮮配制3%H2O2室溫下封閉30min；③抗原修復(fù)；④封閉液封閉，37℃孵育30min；⑤滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（兔抗人CNTF多克隆抗體，兔抗人CNTFRα多克隆抗體），4℃冰箱內(nèi)過夜，同種標(biāo)本以PBS液代替一抗作陰性對(duì)照；⑥滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育 1h；⑦滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(HRP—SP)，37℃孵育30min；⑧DAB顯色10min；⑨蘇木素復(fù)染；⑩梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

切片通過與電腦相連的 Biosens DigitalImaging systemV1.6高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)做細(xì)胞CNTF及CNTFRα蛋白表達(dá)的半定量分析。40×10倍顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取 5個(gè)視野，以胞漿出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，以平均積分光密度值(IOD)表示CNTF及CNTFRα表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

CNTF及 CNTFRα的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（見圖1、2）。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)CNTFRα在兔視網(wǎng)膜組織的表達(dá)（SP×400）

在對(duì)照組中，CNTF與CNTFRα主要存在RGCs層，在其它各層CNTF與CNTFRα呈散在顆粒狀分布。慢性高眼壓損傷后，在視網(wǎng)膜的外核層、外網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)狀層和節(jié)細(xì)胞層CNTF及CNTFR α表達(dá)均顯著增加，并呈彌漫性分布。在造模后7、14、21d與對(duì)照組比較相差非常顯著(P＜0.01)，在造模后第7d，CNTF及CNTFRα表達(dá)最高，在造模后28d仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)（見表1、2）。

表1 造模后對(duì)照組及慢性高眼壓模型各組兔視網(wǎng)膜CNTF及CNTFRα免疫組化染色圖象掃描的平均積光密度值

表2 對(duì)照組及模型組兔視網(wǎng)膜中CNTF及CNTFRα陽性表達(dá)變化趨勢

3 討論

青光眼是一種常見的致盲性眼病，其視神經(jīng)損害的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cell，RGCs)及其神經(jīng)纖維的喪失。多種視神經(jīng)損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究均報(bào)道視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中CNTF表達(dá)增強(qiáng)[5]。我們用免疫組織化學(xué)方法檢測的結(jié)果顯示，在對(duì)照組中RGCs層有大量的CNTF及CNTFR存在，在其它各層也存在散在顆粒狀分布的CNTF及 CNTFR。慢性高眼壓損傷后，CNTF及CNTFR在視網(wǎng)膜外核層、外網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)狀層和節(jié)細(xì)胞層表達(dá)顯著增加，并呈彌漫性分布，CNTF及CNTFR分布區(qū)域相同。Valter等[6]2003年9月報(bào)道用免疫組織化學(xué)方法和用高分辨率的共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在正常的和光損傷的大鼠視網(wǎng)膜中CNTFR主要分布在RGCs層，并且還發(fā)現(xiàn)在其它各層的 CNTFR呈顆粒狀散在分布，而且 CNTF與CNTFR共區(qū)域分布，本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到了同樣的結(jié)果。

有學(xué)者經(jīng)研究認(rèn)為光損害、視神經(jīng)橫切導(dǎo)致了Müller細(xì)胞的活化，并伴隨CNTF分泌表達(dá)增加[7]。我們本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示慢性高眼壓損傷導(dǎo)致了視網(wǎng)膜自身CNTF和CNTFR的表達(dá)增加，最高表達(dá)均在造模后第7d，這可能是Müller細(xì)胞活化的結(jié)果。視網(wǎng)膜通過CNTF和CNTFR表達(dá)增強(qiáng)以減輕神經(jīng)元的變性過程，抑或促進(jìn)其再生和修復(fù)，這可能是節(jié)細(xì)胞一種自我保護(hù)機(jī)制。雖然以往的報(bào)道顯示CNTF能促進(jìn)節(jié)細(xì)胞的存活和再生，但內(nèi)源性的或外源性的 CNTF均未能最終防止節(jié)細(xì)胞的最終死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示慢性高眼壓損傷后雖然出現(xiàn)了 CNTF及CNTFR的表達(dá)增高，但這種增高都未能保持持續(xù)的上升，至 28d表達(dá)有所下降，這是否與微環(huán)境中存在神經(jīng)生長抑制因子的表達(dá)有關(guān)？這些機(jī)制還有待進(jìn)一步詳細(xì)的研究。

[1]Cui Qi, Lu Qiang,So KF, et al.CNTF, not other trophic factors,promotes axonal regeneration of axotomized retinal ganglion cells in adult Hamsters [J].Invest Ophthamol Vis Sci, 1999, 40: 760-766.

[2]Davis S,Aldrich TH, et al.LIFRa and gpl 30 as heterodimerizing signal transducer of the tripartite CNTF receptor[J].Science, 1993, 260:1805-1808.

[3]Sendtner M, Krontzberg GM,Thoenen H.Ciliary neurotrophic factor prevents the degeneration of motor neurons after axotomy[J].Nature, 1990,345:440-441.

[4]徐巖,陳祖基,宋潔貞.復(fù)方卡波姆誘發(fā)的兔高眼壓模型與其它兔高眼壓模型的比較研究[J].中華眼科雜志,2002,38(3):172-175.

[5]Honjo M,Tanibara H, Kido N,et al.Expression of ciliary neurotrophic factor activated by rtinal Müller cells in eyes with NMDA and kainic acid-induced neuronal death[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 2000, 41:552-560.

[6]Valter K, Bisti S, Stone J.Location of CNTFRalpha on outer segments:evidence of the site of action of CNTF in rat retina[J].Brain Res.2003,985(2):169-75.

[7]Harada T,Harada C,Kohsaka S, et al.Microglia-Muller glia cell interactions control neurotrophic factor production during light-induced retinal degeneration[J].JNeurosci.2002,22(21):9228-36.