張琛，楊清，王玉

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

子宮內(nèi)膜癌作為發(fā)病率最高的女性盆腔生殖道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性健康。許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程關(guān)系密切，其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作為最主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法及Western blot檢測(cè)PIK3CB、Akt及p-Akt在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況，探討子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制，為子宮內(nèi)膜癌的診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院2005年1月至2007年12月婦科手術(shù)治療的患者。免疫組化實(shí)驗(yàn)采用蠟塊標(biāo)本58例，其中增殖期子宮內(nèi)膜6例，子宮內(nèi)膜非典型增生7例，子宮內(nèi)膜樣腺癌45例；病理分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期10例；組織學(xué)分級(jí)：高分化（G1）15 例，中分化（G2）20 例，低分化（G3）10例。Western blot采用新鮮標(biāo)本 30例，均為手術(shù)時(shí)取材，取材后立即送-70℃冰箱保存，其中增殖期子宮內(nèi)膜6例，子宮內(nèi)膜非典型增生6例，子宮內(nèi)膜樣腺癌18例。增殖期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜非典型增生及子宮內(nèi)膜樣腺癌均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)，其中子宮內(nèi)膜樣腺癌根據(jù)世界衛(wèi)生組織/國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，患者術(shù)前均未接受過放療、化療或激素治療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)：PIK3CB抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，Akt、p-Akt抗體及SP試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP免疫組化染色按試劑盒說明操作。免疫組化結(jié)果判定：PIK3CB、Akt及p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞染色均為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)。采用MetaMorph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。以積分光密度（integral optical density，IOD）代表蛋白顆粒密度。

1.2.2 Western blot檢測(cè)：取40 μg總蛋白上樣進(jìn)行10%不連續(xù)SDS-PAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，10%脫脂奶粉于室溫封閉濾膜過夜，常規(guī)將轉(zhuǎn)印后的膜依次與一抗和二抗孵育，最后以堿性磷酸酶法顯色目的條帶。Western blot結(jié)果判定：應(yīng)用自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀（Alpha Innotech Corporation 5500型，美國(guó)Alpha Innotech公司）分析蛋白條帶的強(qiáng)弱（以IOD表示）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示PIK3CB、Akt及p-Akt均主要在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，顯微鏡下表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞可見胞質(zhì)呈棕黃色（圖1）。在增殖期子宮內(nèi)膜組織中，PIK3CB、Akt及p-Akt呈弱陽(yáng)性表達(dá)或陰性表達(dá)，在子宮內(nèi)膜非典型增生組織及子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)明顯增高（P<0.05），見表1。值得注意是，在不同臨床病理分期和不同組織類型病理分級(jí)的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中PIK3CB表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在不同組織類型病理學(xué)分級(jí)的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中，Akt及p-Akt的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但與臨床病理分期無關(guān)（P>0.05），見表 2。

表1 PI K3C B、Akt及p-Akt在不同子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)的I O D值Tab.1 I nt egralopt i caldensi t y val ues ofPI K3C B，Aktand p-Akti n di f f erentendom et ri alt i ssues Group n PIK3CB Akt p-Akt Normal proliferative-phase endometrium 6 1.51±0.84 10.57±2.45 15.60±1.65 Atypical endometrial hyperplasia 7 9.96±13.151） 15.06±3.151） 32.89±5.401）Endometrial carcinoma 45 27.81±15.421），2） 38.59±2.871），2） 66.51±6.981），2）1）P<0.05 vs normal proliferative-phase endometrium；2）P<0.05 vs atypical endometrial hyperplasia.

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot定量分析 PIK3CB、Akt及 p-Akt的表達(dá)量，結(jié)果與免疫組化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，在不同類型的子宮內(nèi)膜組織中PIK3CB、Akt及p-Akt蛋白的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），由增殖期子宮內(nèi)膜到子宮內(nèi)膜非典型增生到子宮內(nèi)膜樣腺癌呈增強(qiáng)趨勢(shì)。

表2 PI K3C B、Akt及p-Akt在不同組織學(xué)分級(jí)和病理分期子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中表達(dá)的I O D值Tab.2 I nt egralopt i caldensi t y val ues ofPI K3C B，Aktand p-Akti n di f f erentt ypes ofendom et ri aladenocarci nom a t i ssues by hi st ol ogi calgrade and pat hol ogi calst age Item n PIK3CB Akt p-Akt Histological grade G1 15 25.28±4.98 29.52±4.25 7.33±2.37 G2 20 28.44±3.40 38.84±3.02 12.18±1.43 G3 10 30.36±2.78 51.70±8.22 25.67±2.80 Pathological stageⅠ21 25.63±2.36 34.90±2.88 9.28±2.86Ⅱ14 25.01±1.50 48.90±2.26 12.05±3.07Ⅲ10 36.44±2.30 50.27±8.40 17.48±1.95

3 討論

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，催化亞基PIK3CB作為Ⅰ型PI3K的重要組成部分，在腫瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用：（1）抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖［1，2］。（2）介導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展、促進(jìn)細(xì)胞增殖：PIK3CB可以通過對(duì)周期素依賴性激酶的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)細(xì)胞周期的運(yùn)行。Cyclin E是屬于G期細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，PIK3CB的下調(diào)可以導(dǎo)致Cyclin E顯著下降，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)展［3］。（3）PIK3CB可以誘導(dǎo)致癌性轉(zhuǎn)化：多項(xiàng)研究表明，PIK3CB的高表達(dá)有潛在的誘導(dǎo)致癌性轉(zhuǎn)化作用［4，5］。這可能是因?yàn)镻IK3CB過表達(dá)導(dǎo)致的PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的過度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，PIK3CB不僅通過抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖而與腫瘤發(fā)生有關(guān)，還可影響腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CB主要在細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)量明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜非典型增生組織（P<0.05），Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。由此可見，PIK3CB可能通過抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞正常凋亡而在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Wee等［5］通過對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞系、人惡性膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞系的研究表明，抑制PIK3CB的表達(dá)可以有效的下調(diào)p-Akt的表達(dá)，抑制PC3細(xì)胞及U87MG細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，降低了腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，在抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。在針對(duì)乳腺管癌［7，8］的研究中亦表明，敲除PIK3CB基因能有效地抑制了乳腺管癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。進(jìn)一步說明針對(duì)PIK3CB的干預(yù)治療有可能成為抑制腫瘤增殖和存活的一個(gè)新的治療方法，亦有可能成為子宮內(nèi)膜癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖：（1）Akt的活化可受大量細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的觸發(fā)，從而保護(hù)細(xì)胞免受凋亡。（2）過表達(dá)顯性失活突變Akt基因可促進(jìn)凋亡，而過表達(dá)組成性激活突變Akt基因可抑制凋亡。Akt參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及胃癌中都檢測(cè)出了Akt的過表達(dá)［9］。有研究顯示Akt在胃癌組織中呈高表達(dá)，提示Akt蛋白的高表達(dá)可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡。我們發(fā)現(xiàn)Akt在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中亦呈高表達(dá)，表達(dá)量明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜非典型增生組織（P<0.05），提示Akt的過表達(dá)可能促使子宮內(nèi)膜細(xì)胞逃避凋亡、異常增殖并促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展。

p-Akt作為Akt的活化形式，在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成等方面發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，在許多惡性腫瘤中p-Akt呈持續(xù)高度活化，而且p-Akt的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對(duì)放化療產(chǎn)生的耐受密切相關(guān)［10］。通過我們的研究證實(shí)p-Akt在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜非典型增生組織（P<0.05），表明Akt的磷酸化激活可能是促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、抑制其凋亡的重要原因。Aleskandarany等［11］對(duì)大宗病例的檢測(cè)結(jié)果顯示，76%的早期乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中p-Akt呈高表達(dá)。同樣，對(duì)結(jié)直腸癌的研究提示p-Akt的表達(dá)與結(jié)直腸癌的TNM分期相關(guān)，推測(cè)p-Akt很可能在結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。在本研究中還發(fā)現(xiàn)PIK3CB、Akt及p-Akt在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)量均明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜非典型增生組織（P<0.05），由此推測(cè)在子宮內(nèi)膜癌中，PIK3CB的過表達(dá)能夠上調(diào)Akt及p-Akt的表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，但三者之間的關(guān)系具體如何，還需進(jìn)一步的研究證明。

綜上所述，深入研究PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，不僅有利于闡明子宮內(nèi)膜癌惡性增殖和存活的分子機(jī)制以及加深對(duì)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的了解，還能為臨床預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、基因治療和預(yù)后判斷提供新的有效靶點(diǎn)。

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