李 梅，董建軍，尹 花，郝俊光，余俊紅，楊 梅

(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，青島啤酒股份有限公司，山東青島266034)

麥汁中含有大量的寡糖、麥芽三糖、雙糖和單糖。麥芽四糖以上的寡糖不能被酵母所利用，但這部分糖是構(gòu)成啤酒酒基的重要成分，對(duì)啤酒的泡沫和風(fēng)味具有重要意義。而麥芽三糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖等可發(fā)酵性糖將會(huì)對(duì)啤酒的發(fā)酵過程和最終風(fēng)味產(chǎn)生重要影響。麥汁中各種可發(fā)酵性糖的絕對(duì)含量和相對(duì)比例，都是需要考慮和控制的關(guān)鍵因素。如果葡萄糖含量過高，不提高酯類化合物的含量等［1-3］。所以，糖類化合物是啤酒生產(chǎn)過程的重要參數(shù)。目前國內(nèi)對(duì)于食品中糖類化合物的液相色譜檢測(cè)大多采用氨基柱法［4-5］。這是一種成熟可靠的糖分析方法。缺點(diǎn)是要使用高比例的乙腈作為流動(dòng)相，乙腈毒性很強(qiáng)，氨基柱法將產(chǎn)生大量的有毒廢液，不利于環(huán)保。而且氨基柱本身很脆弱，容易失效，更換頻率較高。此外，氨基柱法無法檢測(cè)麥芽四糖以上的寡糖和糊精。此外，還有文獻(xiàn)利用反向色譜柱檢測(cè)啤酒中 DP1-DP3可發(fā)酵性糖［6-8］，但是分離效果較差，無法準(zhǔn)確定量，這是因?yàn)镃18的填料對(duì)糖類化合物的保留很弱。本文采用兼具體積排阻性質(zhì)和離子交換功能的糖分析柱，以超純水加入少許硫酸作流動(dòng)相。因?yàn)椴惶砑佑卸镜挠袡C(jī)溶劑，方法安全、無毒、環(huán)保、快速準(zhǔn)確。除檢測(cè)果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖外，還可以檢測(cè)麥汁、發(fā)酵液和啤酒中的麥芽四糖以上的寡糖和糊精，而且可以同時(shí)檢測(cè)乳酸、乙酸、丙三醇和乙醇等發(fā)酵產(chǎn)物。此方法也可以作為檢測(cè)啤酒中碳水化合物的分析方法［9-10］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-(-)-阿拉伯糖(＞99%)、D-(+)-果糖(＞98%)、D-(+)-葡萄糖(＞98%)、D-(+)-蔗糖(＞99%)、D-(+)-Maltose hydrate(＞99%)、麥芽三糖(＞96%)、麥芽四糖(＞96%)、麥芽五糖(＞95%)、麥芽六糖(＞95%)、麥芽七糖(＞94%)、Acetic acid(≥99.7%)、Lactic acid(≥85%)均由美國Sigma-Aldrich公司提供;乙腈 色譜級(jí)，由Burdick＆Jackson公司提供;硫酸(＞98%)由國藥集團(tuán)提供。

6110 Balance電子天平 Sartorius公司;Milli-Q超純水機(jī);Phenomenex Rezex糖分析柱 ROA300mm×7.8mm(00H-0138-KO);Kromasil NH2柱 250mm×4.6mm;Waters Alliance 2695液相色譜儀、Waters Column Heater Module、Waters 2414示差折光檢測(cè)器 美國Waters公司。

1.2 色譜條件

色譜柱:Rezex ROA 300mm×7.8mm(00H-0138-KO);流動(dòng)相:0.005N H2SO4水溶液;流速:0.6mL/min;色譜柱溫度:60℃;檢測(cè)器溫度:40℃。

1.3 樣品來源和處理方式

所用樣品均為各啤酒生產(chǎn)廠的寄送樣品。麥汁、發(fā)酵液和啤酒樣品用0.22μm針筒式水性濾膜過濾后，直接進(jìn)樣。如需保存可以放冰箱冷凍保存，使用前解凍并上下?lián)u勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥汁、發(fā)酵液與啤酒樣品分離譜圖

麥汁、發(fā)酵液與啤酒樣品分離譜圖見圖1。麥芽四糖及其以上的糖包括麥芽四糖～十糖的寡糖、糊精、葡聚糖等，保留時(shí)間非常接近，無法完全分離，只能作為一個(gè)整體來定量。這部分糖不能被酵母利用，將作為啤酒的酒基影響啤酒的風(fēng)味和泡沫等其他感官性能。在麥汁中麥芽糖的含量最高，并和蔗糖共流出共同定量。蔗糖、果糖和葡萄糖在發(fā)酵時(shí)被快速徹底利用，絕大多數(shù)的成品啤酒中已經(jīng)無法檢測(cè)到這三種糖。麥芽三糖被酵母部分利用，利用程度同菌種和發(fā)酵條件有關(guān)。丙三醇和乙醇作為發(fā)酵的產(chǎn)物會(huì)在發(fā)酵液和啤酒中大量產(chǎn)生。

圖1 麥汁、發(fā)酵液和啤酒分離譜圖Fig.1 Chromatogram of wort，fermentation broth and beer

2.2 與氨基柱法數(shù)據(jù)對(duì)比及定量方法優(yōu)化

分別用體積排阻法和氨基柱法檢測(cè)多批麥汁樣品。發(fā)現(xiàn)這兩種方法的數(shù)據(jù)有差異(表1)。體積排阻法的數(shù)據(jù)普遍略高于氨基柱法，尤其是麥芽三糖，要高2～3g/L。因?yàn)榘被ǖ柠溠咳亲詈蟪龇?，附近沒有其它色譜峰干擾，而體積排阻法的麥芽三糖和麥芽四糖及以上糖沒有完全基線分離，所以結(jié)果偏高。圖2是麥汁樣品的體積排阻法與氨基柱法的對(duì)比譜圖。

為了消除這種影響，可以先采用氨基柱法準(zhǔn)確定量某一麥汁樣品的麥芽三糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量(色譜條件為:Kromasil NH2柱(250mm×4.6mm)，70%乙腈:30%水作流動(dòng)相，柱溫30℃，流速1.0mL/min)。然后用體積排阻法測(cè)定該批麥汁和其它樣品，且將此麥汁樣品的糖組分?jǐn)?shù)據(jù)作為其他樣品的定量標(biāo)準(zhǔn)，其中麥芽四糖及以上糖采用體積排阻法的數(shù)據(jù)，麥芽三糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖采用氨基柱法的結(jié)果。因?yàn)橐喳溨瓨悠纷鳛闃?biāo)準(zhǔn)樣品比用糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液更接近實(shí)際樣品的糖含量分布，所以可以更好地消除基線干擾。這批經(jīng)過準(zhǔn)確定量的麥汁樣品膜過濾后分裝在小離心管里，放在冰箱中冷凍保存，在每次檢測(cè)時(shí)使用，用以衡量檢測(cè)系統(tǒng)是否穩(wěn)定。即在日常檢測(cè)中，該批麥汁樣品也兼具控制樣品的作用。

圖2 麥汁樣品在兩種方法下對(duì)比譜圖Fig.2 Contrastive chromatogram of the two methods for wort samples

表1 定量方式優(yōu)化前數(shù)據(jù)對(duì)比(g/L)Table 1 Data contrast before optimization of quantification(g/L)

表2列出定量方法優(yōu)化后的結(jié)果，可以看出，各組分的差值都很小，兩種方法的數(shù)據(jù)達(dá)成了一致。

表2 定量方式優(yōu)化后數(shù)據(jù)對(duì)比(g/L)Table 2 Data contrast after optimization of quantification(g/L)

2.3 麥汁和啤酒中阿拉伯糖的檢測(cè)

有文獻(xiàn)報(bào)道過啤酒中的阿拉伯糖［11-12］。我們用阿拉伯糖標(biāo)樣進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示麥汁和啤酒中都沒有阿拉伯糖檢出(圖3)。

圖3 麥汁、啤酒和阿拉伯糖的對(duì)比譜圖Fig.3 Contrastive chromatogram of malt，beer and arabinose standard

2.4 進(jìn)行糖分析的同時(shí)檢測(cè)啤酒中的乳酸、乙酸

在檢測(cè)糖組分的同時(shí)還可以檢測(cè)乳酸、乙酸(圖4)。乳酸和乙酸是兩種影響啤酒口味的重要有機(jī)酸，也是監(jiān)控麥汁和啤酒微生物狀況的敏感指標(biāo)，特別是乙酸，由于其閾值很低，僅有50～60mg/L。但是相對(duì)于糖類化合物的含量，乳酸、乙酸的含量是極其微量的，糖的單位是g/L，而乳酸、乙酸大都不超過200mg/L。

圖4 啤酒樣品乳酸和乙酸的檢測(cè)Fig.4 Detection of lactic acid and acetic acid in beer samples

2.5 方法精密度和靈敏度

對(duì)同一個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)9次，計(jì)算均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差(STDEV)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，%)，得到方法的重復(fù)性數(shù)據(jù)，見表3。也可以對(duì)同一樣品在不同日期檢測(cè)，得到的重現(xiàn)型數(shù)據(jù)更有代表性，以反映方法的實(shí)際重現(xiàn)程度(表4)。兩種條件下的RSD均小于2%。

方法的靈敏度與檢測(cè)器性能、組份分離和雜質(zhì)干擾程度有關(guān)。保留時(shí)間靠前的各組份所受的干擾相對(duì)較多，分離程度也不如后面出峰的組份，所以靈敏度相對(duì)較低。詳見表5。方法的最小檢出限在0.02～0.15g/L，最小定量限在 0.06～0.50g/L。

2.6 麥汁和啤酒糖類化合物的檢測(cè)結(jié)果

表6列出了從13°P到22°P麥汁的糖類化合物含量。同樣的13°P麥汁，麥芽三糖高，則葡萄糖低，這與糖化酶也叫葡糖酶的使用量有關(guān)。加酶量越多，葡萄糖含量越高，麥芽三糖含量越低。表7是啤酒的糖類化合物含量數(shù)據(jù)?？倸堄嗵菫辂溠克奶且陨咸?、麥芽三糖和麥芽糖含量的總和。

表3 方法的重復(fù)性(n=9)Table 3 Repeatability of the method(n=9)

表4 方法的重現(xiàn)性Table 4 Reproducibility of the method

表5 最小檢出限和最小定量限(g/L)Table 5 Limit of detection and quantitation(g/L)

表6 麥汁中糖類化合物的含量(g/L)Table 6 Content of carbohydrates in wort samples(g/L)

表7 啤酒中糖類化合物的含量(g/L)Table 7 Content of carbohydrates in beer samples(g/L)

3 結(jié)論

相對(duì)于氨基柱法，用體積排阻色譜結(jié)合離子交換色譜檢測(cè)啤酒生產(chǎn)過程中的糖類化合物安全無毒、快速、準(zhǔn)確。除檢測(cè)麥汁、發(fā)酵液和啤酒中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖外，還可以檢測(cè)麥芽四糖以上的寡糖和糊精。且在檢測(cè)糖類化合物的同時(shí)還可以檢測(cè)乳酸、乙酸、丙三醇和乙醇，是啤酒生產(chǎn)過程控制的有效監(jiān)控手段。此外，在啤酒和麥汁中均未檢出阿拉伯糖。此方法也可以作為檢測(cè)啤酒中碳水化合物的方法。

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