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        氧化損傷在HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知損害中的作用

        2012-09-05 10:23:14張玉林喬錄新宋鳳麗徐樹瑩陳德喜
        關(guān)鍵詞:鳥嘌呤額葉活性氧

        丁 渭 張玉林 喬錄新 宋鳳麗 徐樹瑩 陳德喜

        (北京市肝病研究所,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京100069)

        對感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV-1)的患者的腦組織進(jìn)行尸檢可以發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,尤其在HIV相關(guān)性癡呆。盡管神經(jīng)相關(guān)癡呆的發(fā)病頻率非常高,而最嚴(yán)重的神經(jīng)認(rèn)知障礙由于抗反轉(zhuǎn)錄病毒試劑的應(yīng)用已開始下降,但在艾滋病患者中仍然存在大量的神經(jīng)認(rèn)知合并癥,這些都?xì)w類為HIV相關(guān)的神經(jīng)認(rèn)知障礙。

        HIV-1感染的非神經(jīng)細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,對轉(zhuǎn)錄反式激活因子(trans-activator of transcription,Tat),病毒蛋白 R(viral protein regulatory,Vpr)和HIV-1包膜糖蛋白gp120通過免疫刺激產(chǎn)生神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性是必需的[1-3]。這些神經(jīng)毒素是興奮性毒素,與谷氨酸受體結(jié)合,主要是C-X-C趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor 4,CXCR4)和 CC趨化因子受體5(C-C chemokine receptor 5,CCR5),使這些受體過度激活。這些過度激活的受體能夠激活細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號通路并使細(xì)胞內(nèi)活性氧增加[3-6]。線粒體活性氧生成后Tat蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)游離鈣離子水平逐步升高[5-6]。因此,HIV-1蛋白,尤其是gp120,Tat和Vpr能夠刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,表明在艾滋病患者中凋亡樣神經(jīng)元死亡是由活性氧介導(dǎo)的。迄今為止發(fā)現(xiàn)的活性氧誘導(dǎo)的所有病變中,DNA和RNA病變最豐富的是8-氧鳥嘌呤(8-hydroxyguanine,8-oxoG)。為了檢測額葉皮質(zhì)中DNA氧化損傷在感染了HIV-1的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷中是否起重要作用,本研究在感染了HIV的中樞神經(jīng)系統(tǒng)對氧化核DNA損傷和線粒體DNA損傷進(jìn)行了研究。此外,我們試圖在艾滋病患者尸檢的額葉組織中檢測8-氧鳥嘌呤的水平,以此作為艾滋病毒導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括HIV相關(guān)的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙患者活性氧水平的生物標(biāo)記。

        1 材料與方法

        1.1 抗體、主要設(shè)備和試劑

        本研究中用到的抗體主要有:抗-8-氧鳥嘌呤(8-oxoG)單克隆抗體(Trevigen公司,美國)、抗-8-氧-20脫氧鳥苷糖甘酶1(OGG1)多克隆抗體(Novus Biologicals,Littleton,CO,美國)、FITC標(biāo)記的抗兔 IgG和Cy3標(biāo)記的抗鼠IgG(Sigma公司,美國)。其他主要試劑有:二氫乙錠(Dihydroethidium)(Invitrogen公司,美國)。病毒載量通過 Nuclisens EasyQ分析儀(Nuclisens EasyQ HIV-1 1.1,biomerieux bv)檢測,而CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)通過流式細(xì)胞儀檢測(BD FACSCalibur,美國)。

        1.2 HIV相關(guān)的神經(jīng)認(rèn)知障礙評估

        HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙采用國際獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)癡呆量表進(jìn)行評分(IHDS),包括記憶-記錄-回憶3個步驟,主要測試運(yùn)動速度和心理運(yùn)動速度[7]。IHDS總分12分。IHDS評分低于或等于10分考慮為HIV-1相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知紊亂(HIV-1 associated neurocognitive disorders,HAND),得分越低越嚴(yán)重。

        1.3 尸檢腦組織標(biāo)本

        本研究中的10例額葉腦組織來源于河南省1994和1995年因商業(yè)性獻(xiàn)血感染了HIV-1的一組艾滋病死亡患者。10例尸檢腦組織標(biāo)本中,5例生前依據(jù)IHDS考慮為HAND,另外5例為非HAND。5例正常額葉皮質(zhì)腦組織標(biāo)本來源于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院神經(jīng)外科腦部腫瘤患者的癌旁腦組織碎片。研究經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。組織采用10%的甲醛固定。

        1.4 免疫熒光染色

        組織玻片保存于-80℃。1×triton穿孔15 min后,1×PBS洗滌15 min×2次;1%BSA+2%羊血清+1×PBS 37℃封閉1 h;1∶1 000濃度抗-8-oxoG,抗OGG1抗體(封閉液稀釋)4℃過夜;1×PBS洗滌15 min×3次;1∶1 000濃度對應(yīng)的Cy3或FITC標(biāo)記IgG二抗(封閉液稀釋)37℃溫育1 h;1×PBS洗滌20 min×3次;DAPI封片后于德國Leica-dm500b型正向熒光顯微鏡下閱片并用Xillix數(shù)碼相機(jī)拍攝相關(guān)圖像(每個點(diǎn)至少選取3個視野,取平均數(shù))。8-oxoG的陽性水平可通過8-oxoG陽性細(xì)胞核/DAPI陽性細(xì)胞核比率算得,OGG1相關(guān)密度可用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

        1.5 DNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR

        使用中國天根公司DNA提取試劑盒,按照使用說明提取基因組DNA。通過實(shí)時(shí)定量PCR相對定量的方法,我們分析了這些尸檢組織中線粒體DNA的拷貝數(shù)變化,包括5例HAND、5例非HAND和5例正常對照。首先,我們對實(shí)際DNA含量與qPCR實(shí)驗(yàn)所獲得的DNA拷貝數(shù)之間關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1A)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測采用已經(jīng)成熟的探針法[8],相對定量。采用 Taqman7900HT系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增線粒體DNA。所有的引物探針均由Invitrogen公司合成(上海,中國),所用序列詳見表1。每個標(biāo)本作3個復(fù)孔,并設(shè)立陰性和陽性對照。引物和探針在反應(yīng)中的終濃度為250和300 nm。反應(yīng)程序依次為:95℃ 3 min,95℃15 s 40個循環(huán),60℃ 1 min。利用Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

        1.6 線粒體DNA D-loop區(qū)的克隆測序

        我們通過PCR的方法從前面提取的腦組織標(biāo)本基因組DNA中擴(kuò)增線粒體DNA D-loop區(qū),再通過BioEdit軟件將克隆測序所得標(biāo)本D-loop區(qū)序列與Gen-Bank線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)序列(NC_012920)進(jìn)行核苷酸進(jìn)化距離分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué),使用高保真的Taq多聚酶(Invitrogen公司,美國),用10 ng總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物根據(jù)廠商說明書連接到pGEM-18T載體(Tankra公司,中國)。所有的序列由中國Biotake公司通過ABI3130序列儀進(jìn)行測序。使用NCBI的BLAST和BioEdit軟件進(jìn)行序列分析。使用7.0.5.3版本BioEdit軟件的Clustal W多序列比對程序進(jìn)行多序列的比對。

        表1 實(shí)驗(yàn)所用引物和探針序列Tab.1 Primer and probe sequences used in the experiment

        1.7 通過K562細(xì)胞檢測AIDS患者腦脊液中超氧化物

        基于熒光技術(shù)二氫乙啶(HE)常被用于檢測細(xì)胞和組織中的超氧化物。HE在細(xì)胞質(zhì)中本身會發(fā)出藍(lán)色熒光(吸收/發(fā)射波長:355/420納米),一旦被氧化形成2-羥基乙啶,與DNA嵌合后會發(fā)出紅色熒光(吸收/發(fā)射波長:518/605納米)[9]。只有當(dāng)它脫氫(氧化)成2-OH-E+后才可以與DNA嵌合。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AIDS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化損傷情況,本研究中,利用穩(wěn)定表達(dá)EGFP綠色熒光的人類白血病K562-EGFP細(xì)胞系和艾滋病患者(包括HAND和非HAND患者)新鮮腦脊液共同孵育15 min。然后利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測K562-EGFP細(xì)胞HE的水平。人類白血病K562-EGFP細(xì)胞一直由本實(shí)驗(yàn)室保存,用含有10%胎牛血清,100U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在加濕的5%CO2培養(yǎng)箱中,接種于6孔板中培養(yǎng)。1×105K562-EGFP細(xì)胞與200 μL的艾滋病患者腦脊液共同孵育15 min為了檢測AIDS患者腦脊液中超氧化物。K562-EGFP細(xì)胞在0.03%H2O2中孵育5 min作為陽性對照,同時(shí)將沒有做任何處理的K562-EGFP細(xì)胞作為陰性對照。去除培養(yǎng)基,加入1×PBS稀釋的儲存濃度為10 mg/mL的HE[于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中儲存](Polysciences公司,美國),使終濃度為 50 μg/mL。避光,37 ℃孵育10 min。最后用BD FACSDiva流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分析(BD FACS CantoTMⅡ)。HE在490 nm波長處被激發(fā),在620 nm波長處可被檢測到。儲存10 000個細(xì)胞的數(shù)據(jù),然后用CellQuest軟件進(jìn)行分析。

        1.8 數(shù)據(jù)分析

        每個樣品均分析了8-oxoG和OGG1,在額葉皮質(zhì)組織中隨機(jī)選取了顯微鏡視野(20×)的10個細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用單因素方差分析進(jìn)行比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 患者一般情況和臨床資料

        10名艾滋病患者,這些患者分別在2006年和2007年去世。其中有7名男性和3名女性,平均年齡為32.9歲(8~56歲)。所有的患者終末期CD4計(jì)數(shù)都很低,平均為31.4(13~56)×106/L。這些患者的HIV-1亞型為HIV-1B亞型。最后一次記錄的平均血漿病毒載量是102 400(28 000-219 000)拷貝/mL;腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)病毒載量未知。所有患者未見中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)會性感染,但是有3例患者合并肺結(jié)核,1例患者合并肺囊蟲感染,1例患者合并淋巴瘤,還有1例患者眼底巨細(xì)胞病毒感染,4例患者沒有任何機(jī)會性感染。IHDS測試表明5例患者有神經(jīng)認(rèn)知障礙(≤10分)。5例對照患者沒有任何機(jī)會性感染、HIV-1感染、未進(jìn)行過化療和放射治療。

        2.2 AIDS患者大腦皮質(zhì)線粒體DNA檢測

        HAND組和非HAND組線粒體DNA拷貝數(shù)下降到正常對照組的(0.69±0.18)倍和(0.74±0.15)倍(圖1B)。這表明,HIV-1慢性感染者的腦組織中線粒體DNA含量明顯下降。但是,在非HAND組和HAND組之間腦組織中線粒體DNA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        表2 患者一般情況和臨床資料Tab.2 General information:dementia rating CD+4T cell,viral load and opportunistic infections of the 10 AIDS patients and 5 control cases

        圖1 HIV-1感染者大腦皮質(zhì)mtDNA缺失Fig.1 Depletion of mtDNA was detected in frontal cortex autopsy tissue from HIV-1 infected patients

        2.3 DNA氧化損傷標(biāo)志物8-oxoG在AIDS患者尸檢皮質(zhì)腦組織中顯著增加

        HAND組和非HAND組患者腦組織中8-氧鳥嘌呤的表達(dá)水平均增加,而且HAND組和非HAND組腦組織8-氧鳥嘌呤的表達(dá)水平增加更加明顯。比較而言,對照組額葉皮質(zhì)組織中幾乎檢測不到8-氧鳥嘌呤的表達(dá)(圖2A)。對3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示HAND組有近45%8-oxoG陽性細(xì)胞,非HAND組有近30%8-oxoG陽性細(xì)胞,而對照組只有4%8-oxoG陽性細(xì)胞(圖2B)。

        發(fā)現(xiàn)AIDS患者尸檢組織中OGG1水平明顯低于對照組,但HAND和非HAND患者之間OGG1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C,D)。

        2.4 艾滋病患者尸檢組織額葉皮質(zhì)中線粒體DNA突變增加

        AIDS患者尸檢組織中D-loop區(qū)DNA突變水平明顯增加。核苷酸進(jìn)化距離是0.047 1(0.012 2-0.122 7);而對照組的5份標(biāo)本中只有2人存在缺失(D310C),沒有突變(圖3A)。進(jìn)一步分析顯示,與對照組相比,HAND尸檢組織在線粒體DNA D-loop區(qū)突變率明顯增高(圖3B),單核苷酸突變數(shù)量在HAND組織中是39,非HAND組織中是13,而在對照組標(biāo)本中僅有2個。HAND患者額葉皮質(zhì)高水平的單核苷酸突變可能與線粒體功能障礙相關(guān),進(jìn)而增加了活性氧的水平。

        2.5 艾滋病患者腦脊液中超氧化物增加

        能夠代表腦脊液中超氧陰離子水平的HE的檢出率隨著HAND的進(jìn)展而逐漸增加:陰性對照為4%,非HAND組為28% ~40%,HAND組為37% ~65%,陽性對照0.3%H2O2組為99%(圖4)。

        圖2 HIV-1感染患者大腦皮質(zhì)腦細(xì)胞核DNA 8-oxoG氧化損傷和OGG1蛋白低表達(dá)Fig.2 High levels of 8-oxoG oxidative DNA damage in nuclear DNA and low levels of OGG1 protein co-exist in frontal cortex autopsy tissue from HIV-1 patients

        圖3 大腦皮質(zhì)腦組織mtDNA D-loop非編碼區(qū)突變分析.Fig.3 Mutation assay of the noncoding region of the mtDNA D-loop in frontal cortex autopsy issue from HIV-1 infected samples and controls

        圖4 AIDS患者腦脊液超氧陰離子水平Fig.4 Level of superoxide in cerebrospinal fluid from AIDS Patients

        3 討論

        HIV-1感染患者的尸檢腦組織可見神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,尤其在HIV相關(guān)癡呆癥患者[10-12]。早期研究[13-16]表明 HIV-1 對神經(jīng)突觸的損害和誘導(dǎo)慢性細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致大腦局部(如海馬和基底節(jié)區(qū))神經(jīng)元的死亡,繼而引起認(rèn)知和運(yùn)動功能障礙。艾滋病患者腦組織中神經(jīng)凋亡的機(jī)制非常復(fù)雜,目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為由于分裂細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)感染了HIV-1后釋放神經(jīng)毒性物質(zhì),繼而產(chǎn)生神經(jīng)毒性[17]。因此,HIV-1蛋白 gp120、Tat和Vpr能夠刺激活性氧的產(chǎn)生這一現(xiàn)象表明艾滋病患者神經(jīng)元凋亡或死亡可能是由活性氧介導(dǎo)的。在細(xì)胞內(nèi),酶促和非酶促抗氧化反應(yīng)組成一個復(fù)雜的防御系統(tǒng)以對抗各種氧化應(yīng)激。然而,HIV-1蛋白在誘導(dǎo)過量活性氧產(chǎn)生的同時(shí),還抑制機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能,從而進(jìn)一步加重氧化損傷對神經(jīng)元的毒性作用。

        眾所周知,線粒體DNA氧化損傷和線粒體DNA缺失是非常嚴(yán)重的損傷,能夠?qū)е戮€粒體呼吸功能下降和細(xì)胞凋亡。此外,慢性神經(jīng)元凋亡是HAND主要的病理改變。本研究中,HIV-1感染時(shí)間均較長。隨著HIV相關(guān)的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙的進(jìn)展,活性氧的產(chǎn)生和氧化線粒體DNA的損傷(突變和缺失)能夠干擾線粒體氧化磷酸化,從而進(jìn)一步誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,加速HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙的進(jìn)展[18-22]。迄今為止發(fā)現(xiàn)的活性氧誘導(dǎo)的所有病變中,DNA和RNA病變最豐富的是8-氧鳥嘌呤,而且可能作為活性氧水平有效的生物標(biāo)志。既往研究[23]表明氧化應(yīng)激可能在HIV感染的神經(jīng)病變中發(fā)揮重要作用,HIV-1感染患者的CD+4T細(xì)胞中8-氧鳥嘌呤水平增加,DNA糖基化酶活性減低;而CD+8T細(xì)胞中8-氧鳥嘌呤的水平與健康對照組相似。我們對HIV-1感染患者尸檢組織額葉皮質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)8-氧鳥嘌呤染色陽性的細(xì)胞占所有DAPI陽性細(xì)胞的45%,但是在健康對照組中只有4%。HIV-1感染的患者尸檢腦組織中氧化損傷DNA的積累以及AIDS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)高水平的活性氧可能在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究的結(jié)果表明活性氧和OGG1能影響艾滋病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中8-氧鳥嘌呤的聚集。另外的試驗(yàn)[24]證明8-oxo-G和OGG1表達(dá)主要在神經(jīng)元細(xì)胞。OGG1可啟動針對DNA損傷的堿基切除修復(fù)。對老齡化和神經(jīng)退行性疾病的研究[18]發(fā)現(xiàn)OGG1活性與8-氧鳥嘌呤積聚呈負(fù)相關(guān)。

        臨床研究[25]發(fā)現(xiàn),阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病以及老齡化可見線粒體DNA突變率和缺失率增加。HIV-1感染和抗病毒治療所用的核苷類似物反轉(zhuǎn)錄抑制劑是線粒體DNA突變和線粒體功能障礙的兩個重要原因[26-27]。心肌細(xì)胞中特異表達(dá)HIV Tat能夠破壞其線粒體;此外,HIV Tat的過表達(dá)能夠抑制線粒體超氧化物歧化酶的表達(dá)[28]。在HIV-1感染早期,病毒即能進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。此后在HIV-1感染大腦的慢性病程中,神經(jīng)免疫的激活以及病毒蛋白的直接毒性能夠增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的水平,導(dǎo)致大量的活性氧產(chǎn)生,包括羥自由基、超氧陰離子和單態(tài)氧等[29]。正如我們初步結(jié)果所揭示的那樣,腦脊液中的超氧化物隨著HAND的發(fā)展而增加,而線粒體基質(zhì)中高水平的活性氧使得細(xì)胞線粒體DNA突變率大大增加。此外,HIV-1感染本身就可以產(chǎn)生氧化應(yīng)激,并且刺激線粒體谷氨酰胺酶過表達(dá),從而在HAND病程中誘導(dǎo)谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路[10,29-30]。因此,我們對線粒體DNA突變和缺失是否與HAND相關(guān)很感興趣,最終研究結(jié)果顯示HIV-1感染的患者尸檢腦組織中存在高水平的線粒體DNA突變和缺失。有研究[31]顯示HIV-1感染和HIV-1蛋白Tat、Vpr可誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生活性氧,從而影響HAND的進(jìn)程。我們的研究結(jié)果顯示HAND和非HAND患者線粒體DNA缺失顯著不同,表明HIV-1相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理過程是非常復(fù)雜的。眾所周知,HIV-1感染的巨噬細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎性細(xì)胞因子,HIV-1蛋白和興奮性氨基酸能夠直接或間接刺激神經(jīng)元產(chǎn)生活性氧,從而損傷細(xì)胞大分子物質(zhì),導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA氧化損傷。在HAND患者腦脊液中檢測到的高水平的活性氧表明,中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性氧與HAND的發(fā)展相關(guān)。氧化應(yīng)激的慢性積累會誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此,確定氧化應(yīng)激在誘導(dǎo)核DNA氧化損傷和線粒體DNA突變,從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用非常重要。同時(shí),這些結(jié)果表明,抗氧化劑治療不乏為預(yù)防和治療HAND的一種有益的選擇。

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