楊贛軍，張小強(qiáng)，孫 弋

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西 吉安 343000)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)發(fā)生于微血管水平的危險并發(fā)癥之一，是腎臟一種慢性進(jìn)行性損害，機(jī)體一旦出現(xiàn)蛋白尿，則病情往往進(jìn)行性發(fā)展至終末期腎臟病(End-stage Renal Disease，ESRD)，需要腎臟替代治療［1］。ROS通過激活蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)及絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK)使轉(zhuǎn)錄因子AP-1激活，啟動其調(diào)控的下游基因轉(zhuǎn)錄，如轉(zhuǎn)化生長因子-1(Transforming Growth Factor-1，TGF-1)、纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)及層粘連蛋白B(Laminin B)等，導(dǎo)致腎組織產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，并使其降解減少，啟動DN的發(fā)病，并參與病情發(fā)展。AP-1是由原癌基因c-fos及c-jun的蛋白產(chǎn)物c-Fos及c-Jun組成的穩(wěn)定的異源二聚體，和DNA的結(jié)合活性很高［2-3］。青刺果Prinsepia utilis Royle為李亞科扁核木屬落葉灌木植物，產(chǎn)于云南、貴州、重慶、四川、西藏和印度。青刺果油富含人體需要的多種營養(yǎng)成分，是一種高級的天然食用油，對治療高血脂、降低膽固醇、防治心血管疾病有重要的輔助作用［4］。青刺果黃酮(FPR)是從青刺果中提取的活性成分，具有良好的降血糖和降血脂的作用［5］。該研究通過觀察青刺果黃酮對糖尿病大鼠腎組織c-fos及c-jun基因表達(dá)的影響，為臨床糖尿病腎病的防治提供新的研究視角及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性SD大鼠15只(清潔級)，體重180～220 g(購自南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部);青刺果黃酮(FPR，從青刺果中提得，臨用前用0.2%的羧甲基纖維素鈉配成15 mg·mL-1青刺果總黃酮的混懸液);抗c-Fos、抗c-Jun多克隆抗體購自Santa Cruz Biotech;Trizol試劑購自美國Gibco BRL公司;c-fos、c-jun及β-actin引物購自上海Sangon公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 雄性SD大鼠15只，大鼠腹腔單劑量注射STZ 65 mg·kg-1，對照組僅注射等量檸檬酸緩沖液。72 h后尾靜脈采血，使用One-TouchⅡ血糖儀測全血血糖，血糖≥16.7 mmol·L-1確定為糖尿病大鼠。

1.2.2 動物分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為3組，即正常對照組(A組)、糖尿病組(B組)及糖尿病FPR治療組(C組)，每組5只。FPR溶于6%乙醇和6%聚乙二醇混合液中，自造模當(dāng)天起腹腔注射300 mg·kg-1·d-1，A組與B組分別給予等量6%乙醇和6%聚乙二醇混合液腹腔注射。大鼠自由飲水、進(jìn)食，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.2.3 RT-PCR 檢測 c-fos及 c-jun mRNA

1.2.3.1 腎組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 于實(shí)驗(yàn)第4周各組分別取5只大鼠宰殺，分離右腎，斷開腎動脈及腎靜脈，用0.1mol·L-1PBS(0℃ ～4℃)經(jīng)腎動脈灌洗右腎5 min，去掉包膜后取右腎皮質(zhì)100 mg，用 0.1 mol·L-1PBS(冰浴) 漂洗 3 min。用Trizol提取腎組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3.2 引物 c-fos 上游引物：5＇-CAGTCTGCTGCATAGAAGGAACCG-3＇; 下游引物 5＇-GAGCTGACAGATACACTCCAAGCG-3＇;擴(kuò)增片斷長432 bp。cjun 上游引物：5-＇CGCAAAGTCTGCCGGCCAATAGGCCGCT-3＇;下游引物 5-＇GCATGAGGAACCGCATTGCCGCCTCCAAGT-3＇;擴(kuò)增片斷長 459 bp。β-actin上游引物：5＇-TACCACTGGCATCGTGATGGACT-3＇;下游引物 5-＇TCCTTCTGCATCCTGTCGGCAAT-3＇;擴(kuò)增片斷長506 bp。

1.2.3.3 PCR 擴(kuò)增取 4 μl cDNA 產(chǎn)物、10%PCR buffer(500 mmol·L-1KCl，100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.3，0.1%gelation，1%Triton X-100)2.5 μl，上游和下游引物50 pmol，1U Taq DAN polymerase，0.2 mmol·L-1dNTPs，加無核酶水至總體積 25 μl，分別擴(kuò)增c-fos、c-jun及β-actin基因。擴(kuò)增條件為94℃3 min，每個循環(huán)94℃ 45 s、退火45 s及72℃ 45 s，循環(huán)35次后，72℃ 延伸5 min。退火溫度：c-fos和c-jun均為60℃，β-actin為65℃。

1.2.3.4 RT-PCR 產(chǎn)物半定量分析 取 15 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳，電壓100 V，時間40 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的位置由100 bp DNA step marker確定。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察結(jié)果，并掃描至計算機(jī)中，采用凝膠分析軟件Gel-Pro Analyzer Version 3.0(Media Cybernetics) 對電泳譜帶進(jìn)行分析，分別以c-fos和c-jun與β-actin mRNA的AU(Aarea.Avalue即凝膠譜帶面積與吸光度乘積)比值表示c-fos和c-jun mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 青刺果黃酮對糖尿病小鼠腎臟臟器指數(shù)的影響 B組小鼠的腎重及腎指數(shù)顯著高于A組，F(xiàn)PR組腎重量在4周末顯著低于B組，腎臟指數(shù)也顯著低于同時間的B組小鼠，說明FPR能降低糖尿病的腎臟指數(shù)，見表1。

表1 糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的變化［±s，ω/mg·g-1］

表1 糖尿病小鼠腎臟指數(shù)的變化［±s，ω/mg·g-1］

注：腎臟指數(shù)=腎重(mg)/體質(zhì)量(g);與正常組比較，1)P ＜0.01;與模型組比較，2)P ＜0.05，3)P＜0.01。

A 18.18 ±0.61 21.21 ±1.22 B 39.21 ±1.441) 41.11 ±1.691)C 29.12 ±1.652) 37.22 ±0.971)3)

2.2 青刺果黃酮對c-fos和c-jun mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果表明，糖尿病大鼠腎組織表達(dá)cfos和 c-jun mRNA 均明顯升高(F=8 007.8，P=0.000;F=7 896.9，P=0.000)(P ＜0.01)，青刺果黃酮對其有顯著抑制作用(P＜0.01)，見表2。

表2 青刺果黃酮對糖尿病大鼠腎組織c-fos和c-jun mRNA表達(dá)的影響［±s，n=5］

表2 青刺果黃酮對糖尿病大鼠腎組織c-fos和c-jun mRNA表達(dá)的影響［±s，n=5］

注：與A 組比較，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與 B 組比較，3)P ＜0.01。

A 0.25 ±0.03 0.27 ±0.04 B 1.15 ±0.051) 1.31 ±0.092)C 0.57 ±0.052)3) 0.63 ±0.052)3)

2.3 青刺果黃酮對c-Fos和c-Jun蛋白表達(dá)的影響A組可見c-Fos和c-Jun蛋白主要在腎小球系膜細(xì)胞核表達(dá)，量極微。B組c-Fos和c-Jun表達(dá)較A組均明顯增加(F=9 007.8，P=0.000;F=8 896.9，P=0.000)(P ＜0.01)。C 組 c-Fos和c-Jun的表達(dá)均受到顯著抑制(P＜0.01)，見表3。

表3 青刺果黃酮對糖尿病大鼠腎小球c-Fos和c-Jun蛋白表達(dá)的影響［±s，n=5］

表3 青刺果黃酮對糖尿病大鼠腎小球c-Fos和c-Jun蛋白表達(dá)的影響［±s，n=5］

注：與 A 組比較，1)P＜0.01;與 B 組比較，2)P＜0.01。

A 0.22 ±0.03 0.23 ±0.03 B 0.97 ±0.041) 1.03 ±0.051)C 0.39 ±0.051)2) 0.42 ±0.041)2)

3 討論

原癌基因參與細(xì)胞生長信息的傳遞，與細(xì)胞的增殖分化密切相關(guān)。糖尿病時腎組織內(nèi)糖代謝紊亂，細(xì)胞外蛋白非酶糖化產(chǎn)生大量晚期糖基化終末代謝產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)，AGEs與存在于細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合使細(xì)胞漿內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，而進(jìn)入胞漿的葡萄糖自動氧化亦產(chǎn)生ROS。ROS激活PKC和MAPK后使轉(zhuǎn)錄因子AP-1發(fā)生磷酸化而被激活，活化的AP-1在細(xì)胞核內(nèi)與受其調(diào)控的基因啟動子上特異DNA序列結(jié)合，啟動相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄。與AP-1結(jié)合的DNA序列包含TGF-β1、FN、Laminin B及纖溶酶原激活物抑制物(plasm inogen activator inhibitor-1，PA I-1)等基因的啟動子，這些基因的表達(dá)均受AP-1調(diào)控［6-8］。上述基因表達(dá)增加將促進(jìn)腎組織細(xì)胞增殖、肥大，使細(xì)胞合成膠原蛋白增加而降解減少，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)堆積及腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)增厚，而引起腎臟肥大，啟動DN的發(fā)病及發(fā)展。

該研究證實(shí)糖尿病大鼠腎組織c-fos及c-jun基因表達(dá)明顯上調(diào)，青刺果黃酮通過抑制糖尿病大鼠腎組織c-fos及c-jun基因表達(dá)而減輕腎臟病理改變，減輕腎皮質(zhì)損傷。其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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