王得文，李愛林

（1.永靖縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅永靖731600；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津300060）

亞低溫治療對神經(jīng)元興奮性毒性損傷影響的研究

王得文1，李愛林2*

（1.永靖縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅永靖731600；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津300060）

目的研究谷氨酸(Glutamate,Glu)對神經(jīng)元凋亡和細胞膜損傷的影響，探討亞低溫對神經(jīng)元的保護作用。方法取孕14 d SD大鼠的胚胎腦組織培養(yǎng)神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞誘導分化6 d的神經(jīng)元分為37℃陰性對照組(不加入谷氨酸)、37℃陽性對照組(加入50μmol/L的谷氨酸)、29℃實驗組(加入50μmol/L的谷氨酸)；同時進行的還有31℃、33℃、35℃谷氨酸損傷模型亞低溫實驗組。觀察Bax表達的變化，測定甘油(Glycerol，Gly)含量和培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活力。結(jié)果(1)29℃實驗組：Bax表達29℃組最高，其次為37℃陽性組，而37℃陰性組最低；培養(yǎng)液上清中LDH活力和Gly均為29℃組最高，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為29℃組最低，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最高。(2)31℃、33℃和35℃實驗組：上清LDH活力、Gly和神經(jīng)元Bax表達均為37℃陽性組最高，其次為31℃組、33℃和35℃實驗組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為31℃組，37℃陰性組最高。結(jié)論谷氨酸是導致神經(jīng)細胞膜損傷和凋亡的原因之一；31℃～35℃亞低溫治療可以降低凋亡促進基因Bax的表達，減輕神經(jīng)元細胞膜的損傷。

亞低溫；谷氨酸；Bax

研究表明谷氨酸(Glutamate，Glu)的興奮性毒性是導致凋亡的重要原因之一[1]，有學者已經(jīng)對神經(jīng)損傷后各種藥物的腦保護作用進行了研究[2]。本文通過體外培養(yǎng)神經(jīng)元的谷氨酸損傷模型，進一步研究興奮性毒性對神經(jīng)元凋亡的影響以及亞低溫治療對Glu損傷神經(jīng)細胞膜的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料(1)實驗動物：孕14 d SD大鼠4只，購自軍事醫(yī)學科學院第四研究所。(2)試劑：纖維母細胞生長因子-2(FGF-2，Pepretech公司)、表皮細胞生長因子(EGF，Pepretech公司)、Nestin、MAP2、Bax和Bcl2免疫組化試劑盒(中國北京中山公司)。(3)器材：CO2培養(yǎng)箱(IG150，Jouan公司，法國)，倒置相差顯微鏡(NIKON，日本)，三氣培養(yǎng)箱(95%氮氣+5%氧氣+ 5%二氧化碳，Heraeus公司，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 神經(jīng)細胞的培養(yǎng)鼠胚胎大腦神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)：取孕14 d的SD孕鼠，無菌處理后取胚胎腦組織，加等體積的0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，令其消化分散成單細胞懸液。在IMDM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)神經(jīng)干細胞。

1.2.2 神經(jīng)干細胞鑒定在培養(yǎng)第三代胎鼠大腦海馬NSC中干細胞巢蛋白(nestin)免疫熒光染色陽性，神經(jīng)干細胞呈球體聚合狀懸浮生長，細胞團呈圓型，顯示細胞正處于未分化生長狀態(tài)，經(jīng)nestin一抗和免疫熒光二抗標記呈綠色熒光球體，表明為正常生長的神經(jīng)干細胞。

1.2.3 神經(jīng)干細胞的誘導分化上述各組經(jīng)6 d培養(yǎng)后收集細胞，離心棄上清，各組細胞重新懸浮于含10%FBS、N2和BDNF(20μg/L)的IMDM培養(yǎng)液中，接種于24孔板(已涂布明膠)，繼續(xù)培養(yǎng)6 d后，用4%多聚甲醛固定30 min，進行MAP2免疫組織化學染色，鑒定分化的神經(jīng)元。

1.2.4 細胞存活率計算MAP2陽性率為存活的神經(jīng)元。通過鏡下觀察免疫組化染色可清楚區(qū)分死亡神經(jīng)元和正常神經(jīng)元，這些神經(jīng)元MAP2染色呈陰性，因此在進行存活神經(jīng)元計數(shù)過程中，選擇胞體和突起染色均為陽性并且結(jié)構(gòu)完整的細胞。

1.2.5 制做Glu損傷模型神經(jīng)干細胞分化6 d的谷氨酸損傷模型亞低溫實驗分組如下：37℃陰性對照組(不加入谷氨酸)、37℃陽性對照組(加入50μmol/L的谷氨酸)、29℃實驗組(加入50μmol/L的谷氨酸)；同時進行的還有31℃、33℃、35℃谷氨酸損傷模型亞低溫實驗組。

1.2.6 乳酸脫氫酶活力測定神經(jīng)元細胞培養(yǎng)液上清中LDH的活力(U/L)=(測定管OD值-測定空白管OD值)/(標準管OD值-標準空白管OD值)×標準管濃度(2 μmol/ml)×1 000 ml×測定前樣品稀釋倍數(shù)。細胞中LDH活力(U/gprot)=(測定管OD值-測定空白管OD值)/(標準管OD值-標準空白管OD值)×標準管濃度(2 μmol/ml)÷蛋白濃度(gprot/ml)。

1.2.7 Bax表達變化的觀察和Gly測定免疫組化染色(按ABC試劑盒程序)觀察Bax表達的變化，細胞呈棕黃色為陽性，陰性則為胞漿無色。陽性細胞計數(shù)：200×光鏡下，隨機選取6個區(qū)域，每個區(qū)域用目鏡網(wǎng)格測微尺計算陽性細胞密度，以陽性細胞/網(wǎng)格范圍內(nèi)的細胞總數(shù)，分別計數(shù)細胞總數(shù)陽性細胞數(shù)，以百分率計算陽性細胞數(shù)，每組數(shù)據(jù)計算均數(shù)與標準差。微透析分析儀測定神經(jīng)元培養(yǎng)液中Gly的含量。

1.3 統(tǒng)計學方法用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行處理。各種生化成分及比率的組間差異顯著性用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較用S-N-K法。

2 結(jié)果

2.1 正常培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元及谷氨酸對神經(jīng)元的損傷作用

2.1.1 神經(jīng)微管相關(guān)蛋白2(MAP2)免疫組化染色培養(yǎng)6 d的神經(jīng)元經(jīng)MAP2染色，可見胞漿被染成棕黃色，陽性率達18.21%～22.34%。

2.1.2 谷氨酸對體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元形態(tài)學的影響在相差顯微鏡下觀察，37℃陽性組細胞體積變小，染色質(zhì)凝聚在核膜下呈半月狀，部分軸突增粗甚至發(fā)生斷裂，細胞光暈減弱或消失，細胞膜增厚、粗糙，部分細胞死亡崩解。

2.2 亞低溫治療對Bax、LDH和Gly的影響

2.2.1 29℃實驗組亞低溫治療效果29℃亞低溫治療對細胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH(U/L)、Gly(μmol/L)和Bax表達的影響見表1。Bax表達29℃亞低溫治療組最高，其次為37℃陽性組，而37℃陰性組最低。上清LDH活力和Gly均為29℃組最高，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為29℃組最低，其次為37℃陽性組，37℃陰性組最高。

2.2.2 31℃實驗組亞低溫治療效果31℃實驗組亞低溫治療對細胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH (U/L)、Gly(μmol/L)和Bax表達的影響見表2。上清LDH、Gly和神經(jīng)元Bax表達均為37℃陽性組最高，其次為31℃組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為31℃組，37℃陰性組最高。

2.2.3 33℃實驗組亞低溫治療效果33℃實驗組亞低溫治療對細胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH (U/L)、Gly(μmol/L)和Bax的影響見表3。上清LDH、Gly和神經(jīng)元Bax表達均為37℃陽性組最高，其次為33℃組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為33℃組，37℃陰性組最高。

2.2.4 35℃實驗組亞低溫治療效果35℃實驗組亞低溫治療對細胞中LDH(U/gprot)、上清中LDH (U/L)、Gly(μmol/L)和Bax的影響見表4。上清LDH、Gly和神經(jīng)元Bax表達均為37℃陽性組最高，其次為35℃組，37℃陰性組最低；細胞中LDH活力為37℃陽性組最低，其次為35℃組，37℃陰性組最高。

表1 29℃實驗組亞低溫治療效果()

表1 29℃實驗組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

項目上清LDH(U/L)細胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 301.47 567.62 26.17 168.81 37℃陽性602.0±4.27*1116.24±26.60*98.68±24.75*0.38±0.039*37℃陰性586.86±2.90 1670.24±26.60 49.78±11.07 0.12±0.008 29℃649.48±7.64*#837.47±23.68*#120.80±21.83*#0.48±0.056*#0.00 0.00 0.00 0.00

表2 31℃實驗組亞低溫治療效果()

表2 31℃實驗組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

項目上清LDH(U/L)細胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 324.8 187.9 11.71 178.3 37℃陽性557.73±2.67*1217.45±20.97*104.88±12.58*0.38±0.037*37℃陰性534.53±4.77 1398.52±25.10 52.13±15.77 0.12±0.009 31℃516.75±1.11*#1351.72±7.65*#76.64±31.97*#0.21±0.029*#0.00 0.00 0.00 0.00

表3 33℃實驗組亞低溫治療效果()

表3 33℃實驗組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

項目上清LDH(U/L)細胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 77.03 21.70 16.20 182.4 37℃陽性747.16±60.97*985.31±19.76*103.61±11.26*0.38±0.040*37℃陰性520.36±16.01 1679.38±28.56 53.41±12.49 0.12±0.009 33℃609.27±9.73*#1235.59±12.65*#73.64±25.72*#0.21±0.027*#0.00 0.00 0.00 0.00

表4 35℃實驗組亞低溫治療效果()

表4 35℃實驗組亞低溫治療效果()

注：與37℃陰性組比較，*P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義；與37℃陽性組比較，#P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

項目上清LDH(U/L)細胞LDH(U/gprot) Gly Bax P F 77.03 103.3 9.15 50.3 37℃陽性700.52±5.81*1476.28±9.96*110.91±24.28*0.38±0.067*37℃陰性629.89±6.04 1646.15±43.28 68.07±12.72 0.12±0.095 35℃669.85±6.83*#1640.51±13.81*#89.71±21.27*#0.22±0.059*#0.000 0.000 0.001 0.000

3 討論

3.1 Glu損傷模型的建立腦損傷體外模型能消除在體時各種復雜因素的影響，觀察某種特定細胞的病理生理變化，提供一些在體研究不能得到的信息，因此近年來倍受關(guān)注。為探討興奮性毒性物質(zhì)引起腦組織特定細胞膜損傷的機制及亞低溫的治療作用，本實驗采用Meade等[3]的Glu損傷模型。

細胞系對生長條件要求較低，易于培養(yǎng)，可以凍存和無限傳代。細胞系持續(xù)分化的特性表明它們的基因表型和蛋自表達已與正常的細胞顯著不同，因此本研究未采用細胞系作為研究對象。神經(jīng)元是終末分化細胞，分離純化十分困難，采用神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)和MAP2免疫組化對培養(yǎng)細胞鑒定的技術(shù)，既可研究Glu對神經(jīng)元的損傷作用的同時混合培養(yǎng)又可模擬體內(nèi)真實的環(huán)境。用新生鼠直接進行神經(jīng)元培養(yǎng)，在分離過程中可能造成細胞損傷且獲得的神經(jīng)元數(shù)量較少，故本研究首先用胎鼠進行神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)，然后通過誘導分化獲得大量混合培養(yǎng)的神經(jīng)元。

本研究成功制作了Glu誘導的凋亡模型。形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，37℃陽性組海馬細胞神經(jīng)元與37℃陰性組神經(jīng)元相比較，細胞體積變小，染色質(zhì)凝聚在核膜下呈半月狀，部分軸突增粗甚至發(fā)生斷裂，細胞光暈減弱或消失，部分細胞死亡崩解。37℃陽性組Bax陽性細胞率顯著高于37℃陰性組，支持鏡下結(jié)果，證明Glu損傷的神經(jīng)元凋亡促進基因表達活躍。

3.2 Glu的興奮性毒性及亞低溫治療的保護作用近年研究表明，在退行性疾病(如阿爾茲海默氏病、帕金森氏病)、腦缺血性損傷和腦創(chuàng)傷后凋亡都參與了腦細胞死亡的機制[4]。Bax基因?qū)毎蛲鲇写龠M作用，本研究選擇Bax蛋白表達進行研究，以期進一步深入了解亞低溫治療對凋亡的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)Glu損傷后的神經(jīng)元表達顯著高于無Glu損傷的神經(jīng)元，而31℃、33℃和35℃亞低溫治療可以顯著減少因Glu的興奮性毒性所致的Bax表達，提示亞低溫治療通過抑制Bax表達而減少損傷神經(jīng)元的凋亡。但29℃低溫治療6 d后，Bax表達高于未治療的Glu損傷的神經(jīng)元。對于亞低溫治療的安全溫度窗不同學者看法不同，Zhao等[5]通過剝奪血清的方法誘導海馬神經(jīng)元凋亡，也發(fā)現(xiàn)與本實驗類似的結(jié)果，并認為29℃低溫治療6 d可產(chǎn)生凍傷作用，導致細胞凋亡。因此作者認為應慎用29℃的亞低溫治療，并對治療溫度進行更深入的研究。

乳酸脫氫酶的釋放率可以作為細胞膜損傷的標志。正常情況下釋放很少，當細胞膜的通透性增高或完整性喪失時，LDH擴散進入胞外介質(zhì)。對31℃、33℃和35℃組上清中LDH的測定表明，37℃陽性組LDH最高，其次為31℃、33℃和35℃亞低溫治療組，而37℃陰性組最低；對細胞內(nèi)LDH的測定則相反，37℃陽性組LDH明顯降低，37℃陰性組最高，Gly的變化與LDH相似，表明谷氨酸的興奮性毒性是造成細胞膜損傷的原因之一，亞低溫治療對谷氨酸的興奮性毒性造成的細胞膜損傷具有保護作用。29℃實驗組出現(xiàn)了與其他三組不同的結(jié)果，上清中29℃組LDH最高，其次為37℃陽性組，而37℃陰性組最低，表明6 d的29℃亞低溫治療不但未產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，反而造成了細胞膜的損傷。Alm等[6]將培養(yǎng)的神經(jīng)細胞暴露于低濃度的神經(jīng)興奮性毒素，大多數(shù)的細胞表現(xiàn)出染色質(zhì)凝聚、凋亡小體形成等凋亡的形態(tài)學改變。本研究支持凋亡過程存在細胞膜的損傷，LDH和Gly的濃度變化提示，凋亡誘導的細胞膜損傷可引起Gly濃度升高，支持Gly可作為細胞膜損傷的標記，為臨床通過微透析監(jiān)測Gly指導治療提供了依據(jù)。

[1]Lee BK,Jung YS.The Na+/H+exchanger-1 inhibitor cariporide prevents glutamate-induced necrotic neuronal death by inhibiting mitochondrial Ca2+overload[J].J Neurosci Res,2012,90(4)：860-869.

[2]石少波,魏文祥.?；撬釋Υ笫缶凭阅X損傷組織中TNF-α水平的影響[J].海南醫(yī)學,2010,21(24)：36-37.

[3]Meade AJ,Meloni BP,Mastaglia FL,et al.AP-1 inhibitory peptides attenuate in vitro cortical neuronal cell death induced by kainic acid [J].Brain Res,2010,1360：8-16.

[4]Farooqui AA.Lipid mediators in the neural cell nucleus：their metabolism,signaling,and association with neurological disorders[J]. Neuroscientist,2009,15(4)：392-407.

[5]Zhao R,Cui Q,Yu SQ,et al.Antegrade cerebral perfusion during deep hypothermia circulatory arrest attenuates the apoptosis of neurons in porcine hippocampus[J].Heart Surg Forum,2009,12(4)：219-224.

[6]Alm H,Kultima K,Scholz B,et al.Exposure to brominated flame retardant PBDE-99 affects cytoskeletal protein expression in the neonatal mouse cerebral cortex[J].Neurotoxicology,2008,29(4)：628-637.

Effect of hypothermia on cell membrane damage of glutamate-induced hippocampal neurons.

WANG De-wen1, LI Ai-lin2*.1.Department of Neurology,People's Hosptal of Yongjing County,Yongjing 731600,Gansu,CHINA;2. Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300060,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Glutamate(Glu)on neuronal apoptosis and cell membranedamage,and analyze the protective effect of hypothermia on neurons.MethodsThe embryonic brain tissue from SD rats with 14 days of pregnancy were extracted and cultured for neural stem cells.After induced differentiation for 6 d, the neurons were divided into 37℃negative control group(with no Glutamate),37℃positive control group(50μmol/L Glutamate),29℃study group(50μmol/L Glutamate),31℃study group,33℃study group,35℃study group.The expression of Bax was observed,and the content of Glycerol(Gly)as well as the activity of Lactate dehydrogenase(LDH) were investigated.Results(1)The express level of Bax was highest in the 29℃study group,followed by the 37℃positive control group,and lowest in the 37℃negative control group.The activity of LDH in the culture supernatant and Gly was the highest in 29℃study group,followed by the 37℃positive control group,and lowest in the 37℃negative control group.The activity of LDH in cell was the lowest in 29℃study group,followed by the 37℃positive control group,and the highest in the 37℃negative control group.(2)The activity of LDH in the culture supernatant,Gly,the expression level of Bax were the highest in the 37℃positive control group,followed by the 31℃study group,33℃study group,35℃study group,and was the lowest in the 37℃negative control group.The activity of LDH in cell was the lowest in the 37℃positive control group,followed by the 31℃study group,and was the highest in the 37℃negative control group.ConclusionGlutamate is one of the main factors that lead to neuronal apoptosis and cell membrane damage.Hypothermia(31℃～35℃)can inhibit apoptosis and cell membrane damage,and promote the expression of Bax.

Hypothermia;Glutamate;Bax

R454.5

A

1003—6350(2012)22—024—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.008

2012-05-15)

王得文（1969—），男，甘肅省永靖縣人，副主任醫(yī)師。

*通訊作者:李愛林，副主任醫(yī)師，神經(jīng)外科學博士。E-mail:lailwq@yahoo.com.cn