卞國(guó)奉，陳愛(ài)軍

(1.三峽大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北宜昌443003；2.宜昌市中心人民醫(yī)院普外三科，湖北宜昌443003)

miR-21、miR-155在乳腺癌患者血液與腫瘤組織中表達(dá)水平的相關(guān)性研究

卞國(guó)奉1，陳愛(ài)軍2*

(1.三峽大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北宜昌443003；2.宜昌市中心人民醫(yī)院普外三科，湖北宜昌443003)

目的對(duì)健康女性血清及乳腺癌患者血清中miR-21和miR-155表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，同腫瘤患者癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織的miR-21和miR-155表達(dá)水平的變化趨勢(shì)相比較，以評(píng)價(jià)血清中miR-21和miR-155在乳腺癌早期診斷中的潛在價(jià)值。方法收集健康女性血液和患者血液與患者癌組織和癌旁組織，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)提取的RNAmiR-21和miR-155進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，得到miR-21和miR-155在血清中變化趨勢(shì)與在組織中變化趨勢(shì)的相關(guān)性。結(jié)果miR-21和miR-155在腫瘤組織的表達(dá)水平明顯高于其在癌旁組織的表達(dá)水平，miR-21和miR-155在乳腺癌患者血清中的表達(dá)水平也要高于其在健康體檢者血清中的表達(dá)水平。血清中miR-21和miR-155表達(dá)水平變化趨勢(shì)與組織中miR-21和miR-155表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致。結(jié)論血清中miR-21和miR-155能反映乳腺癌的發(fā)生，miR-21和miR-155有可能作為乳腺癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。

MicroRNA；乳腺癌；腫瘤標(biāo)記物；miR-21；miR-155

MicroRNA(又叫miRNA或微RNA)是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA，廣泛存在于動(dòng)物、植物和病毒中，通過(guò)與目標(biāo)mRNA的3'UTR序列互補(bǔ)配對(duì)，調(diào)控靶基因的表達(dá)或翻譯，參與生物體的發(fā)育、炎癥、腫瘤等多種生理、病理過(guò)程[1-3]。最近發(fā)現(xiàn)MicroRNA常常在癌癥中異常表達(dá)，一些MicroRNA在癌癥中上調(diào)，而另一些則下調(diào)。MicroRNA在乳腺癌中表達(dá)譜的研究提示了可能作為一種新的疾病診斷，分類和預(yù)后判斷的工具，越來(lái)越多的證據(jù)表明MicroRNA的分析可以用于惡性腫瘤的診斷、預(yù)后判斷和治療[4-6]。

俄亥俄大學(xué)Croce的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種MicroRNA是成功鑒別正常組織與腫瘤組織所必需的，本實(shí)驗(yàn)以癌組織比癌旁組織表達(dá)量升高的miR-21、miR-155為代表[3]，以U6作為參照物分析患者血清、健康女性血清中miRNA的變化趨勢(shì)和癌組織、癌旁組織miRNA變化趨勢(shì)的相關(guān)性，得到血清miRNA作為腫瘤標(biāo)志物早期診斷乳腺癌的可能性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料41例乳腺癌患者腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣≤3 cm)、術(shù)前外周血各一份。并收集健康女性體檢者外周血41份，保存至超低溫冰箱中。所有患者取血之前均未進(jìn)行手術(shù)、化療、放療或內(nèi)分泌治療。不限制患者的年齡、腫瘤分級(jí)和分期，但既往有腫瘤病史和其他部位轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤排除在外。正常對(duì)照者為同一時(shí)期進(jìn)行年度體檢的正常人群，入選標(biāo)準(zhǔn)是無(wú)腫瘤病史和臨床體征的女性健康體檢者。所有標(biāo)本均來(lái)自宜昌市中心人民醫(yī)院。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)于Fermentas；RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司(DP433)；SYBR熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Fermentas；引物合成由南京金斯瑞生物科技有線公司完成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Illumine eco；離心機(jī)購(gòu)于Eppendorf。

1.3 相關(guān)引物miR-21：loop primer5'-GTCGT ATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACTCAAC-3'，上游引物：5'-TGCGCTAGCTTA TCAGACTGAT-3'，下游引物：5'-CCAGTGCAGGGT CCGAGGTATT-3'；miR-155：loop primer5'-GTCGTA TCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACGGGGT-3'，上游引物：5'-TGCGCTAATGCT AATCGTGATA-3'，下游引物：5'-CCAGTGCAGGGTC CGAGGTATT-3'；U6上游引物：5'-CGCTTCGGCAG ACATATAC-3'，下游引物：5'-AAATATGGAACGCTT CACGA-3'。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 TRIzol法提取RNA嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書操作。所有標(biāo)本經(jīng)紫外分光光度檢測(cè)OD260/OD280比值為1.8～2.0方可進(jìn)行后續(xù)操作。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄按如下成分配置反應(yīng)體系：TotalRNA、miRNA-loop primer(內(nèi)參基因加Oligo dT)、dNTP，并用水補(bǔ)不足。70℃5 min，短暫離心后置于冰上急冷。然后在管中加入5×RT buffer、HRP(RRI)/ RNase Inhibitor、M-MLV、ddH2O(Rnase free)，置于儀器上42℃60 min，95℃5 min。

1.4.3 PCR擴(kuò)增按如下成分配置反應(yīng)體系：miRNA上游引物，下游引物，dDNTP，ExTaq，10×ExTaqE buffer，cDNA，ddH2O。反應(yīng)條件94℃4 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃25s；72℃4 min，4℃4 min，35個(gè)循環(huán)。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR按如下成分配置反應(yīng)體系：cDNA，上游引物，下游引物，SYBR Green/ Flourescein qPCR Master Mix，ddH2O，反應(yīng)條件：Cycle 1：(1×)50.0℃2 min，95.0℃10 min，Cycle 2：(40×)95.0℃30 s，60.0℃30 s。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)，采用定量PCR中的相對(duì)定量法，用檢測(cè)到的Ct值，以U6 ncRNA的量為內(nèi)參照，以癌旁組織和健康女性血清為對(duì)照，計(jì)算miR-21//155的相對(duì)量，計(jì)算公式：F＝2－△△Ct，△△Ct＝(CtmiR-21/155-CtU6 ncRNA)腫瘤/血清-(CtmiR-21/155-CtU6 ncRNA)對(duì)照，F(xiàn)代表miR-21/155在腫瘤組織或血清的表達(dá)相對(duì)于配對(duì)癌旁組織或健康女性血清的差異表達(dá)倍數(shù)。配對(duì)設(shè)計(jì)資料用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各標(biāo)本總RNA吸光度比值總RNA提取之后，將其加入DEPC水中(稀釋100倍)，測(cè)260 nm、280 nm吸收值，計(jì)算OD260/280比值和濃度(μg/ml)，本實(shí)驗(yàn)總RNA溶液OD260/280比值波動(dòng)于1.8～2.0，說(shuō)明提得的總RNA純度較高，符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.2 miRNA擴(kuò)增曲線miR-21、miR-155、U6 ncRNA的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1，分為三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、指數(shù)擴(kuò)增階段、平臺(tái)期。其形狀是一條平滑的S型曲線。

2.3 miRNA溶解曲線miR-21、miR-155、U6 ncRNA擴(kuò)增產(chǎn)物顯示單一溶解峰，見(jiàn)圖2，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)合理，無(wú)非特異性擴(kuò)增，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 標(biāo)本實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果經(jīng)公式計(jì)算miR-21/155的相對(duì)表達(dá)量，患者血清中miR-21相對(duì)表達(dá)量為健康女性的2.387倍，血清中miR-155相對(duì)表達(dá)量則為2.274倍?；颊吣[瘤組織中miR-21相對(duì)表達(dá)量為癌旁組織的1.638倍，組織中miR-155相對(duì)表達(dá)量則為2.137倍。以上分析結(jié)果提示在乳腺癌患者血清miRNA的變化趨勢(shì)與組織中的一致。采用配對(duì)樣本的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明這兩個(gè)指標(biāo)的變化均能提示乳腺癌的發(fā)生，miR-21/155有成為乳腺癌腫瘤標(biāo)記物的可能，可以用于乳腺癌的早期診斷。

圖1 U6 ncRNA、Hsa-miR-155、Hsa-miR-21擴(kuò)增曲線

圖2 U6 ncRNA、Hsa-miR-155、Hsa-miR-21溶解曲線

3 討論

近年來(lái)的研究結(jié)果表明，miR-21和miR-155在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到了關(guān)鍵作用，Iorio等[7]采用微陣列和Northern印跡方法發(fā)現(xiàn)，miR-155和miR-21在乳腺癌組織中高表達(dá)幾倍到幾十倍。但它們引起乳腺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制鮮被報(bào)道。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime RT-PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，于1996年由美國(guó)Applied biosystems公司推出。相對(duì)于普通的PCR，操作時(shí)受污染的機(jī)會(huì)少、自動(dòng)化程度高、功能強(qiáng)大、省時(shí)、特異性和靈敏度也較高。成熟的MicroRNA長(zhǎng)平均長(zhǎng)度為22 nt，同類的MicroRNA甚至只有一兩個(gè)堿基的差別，且提取出來(lái)的RNA易受外界污染，這些特點(diǎn)給傳統(tǒng)的Northern blot、Microarray、RT-PCR等常規(guī)檢測(cè)手段帶來(lái)了極大的困難和挑戰(zhàn)，其結(jié)果特異性也不強(qiáng)[8]。本實(shí)驗(yàn)采用Realtime RT-PCR檢測(cè)組織與血液里miR-21和miR-155的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)吸光度表達(dá)，溶解曲線單峰及對(duì)照結(jié)果，可以看出采用莖環(huán)RT逆轉(zhuǎn)錄引物的Realtime RT-PCR技術(shù)對(duì)乳腺癌相關(guān)MicroRNA的檢測(cè)靈敏性較高，檢測(cè)結(jié)果可信度高。腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移都伴隨著miRNA表達(dá)譜的變化[9]。大多數(shù)情況下，腫瘤組織中的miRNA表達(dá)水平比正常組織低，也有部分miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平升高。本實(shí)驗(yàn)選取的兩個(gè)miRNA在腫瘤樣品中都與血液樣品中表達(dá)水平均上調(diào)，與腫瘤的發(fā)生有正向調(diào)節(jié)作用。因?yàn)镸icroRNA在組織及血液中表達(dá)量甚微，實(shí)驗(yàn)選取的兩個(gè)指標(biāo)上調(diào)，相對(duì)于負(fù)向調(diào)節(jié)作用的MicroRNA，更容易被檢測(cè)到，為miR-21和miR-155成為乳腺癌腫瘤標(biāo)記物提供了幫助。

實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析可以采用相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N方法，如果需要知道絕對(duì)的拷貝數(shù)，就必須用絕對(duì)定量的方法，否則只需要給出基因表達(dá)相對(duì)量就足夠了。相對(duì)定量可能比絕對(duì)定量要更容易一些，因?yàn)樗恍枰鳂?biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)定量法，通過(guò)2－△△Ct法分析相對(duì)基因表達(dá)差異更簡(jiǎn)單方便。

本實(shí)驗(yàn)中乳腺癌患者腫瘤組織中miR-21和miR-155的相對(duì)表達(dá)量明顯大于癌旁正常組織的表達(dá)，患者血清中的miR-21和miR-155的相對(duì)表達(dá)量亦明顯大于健康女性血清中的表達(dá)，組織與血清中的miR-21和miR-155變化趨勢(shì)相一致，提示miR-21和miR-155這兩個(gè)指標(biāo)有成為乳腺癌腫瘤標(biāo)記物的可能，可用于乳腺癌的早期診斷。這種方法也可以推廣到其他腫瘤中去，找出各個(gè)腫瘤中特異性較高的MicroRNA，在更多實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上證明MicroRNA是一種可靠的生物標(biāo)記，且能被簡(jiǎn)單準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)。如此，將會(huì)在極大程度上促進(jìn)腫瘤的早期診斷的發(fā)展，為患者贏得寶貴的時(shí)間。

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Correlation study of the expression of miR-21 and miR-155 in the blood and tumor tissue of patients with breast cancer.

BIAN Guo-feng1,CHEN Ai-jun2.1.The First Clinical College of China Three Gorges University, Yichang,443003,Hubei,CHINA;2.The Third Department of General Surgery,the Central Hospital of Yichang City, Yichang 443003,Hubei,CHINA

ObjectiveTo evaluate the expression levels of miR-21 and miR-155 in the serum of breast cancer patients and healthy women by real-time quantitative PCR,compared with the variation trend of the expression level of miR-21 and miR-155 in tumor tissue samples.MethodsThe samples were collected from the intraoperative tumor tissue,adjacent tissue,and the peripheral blood of patients and from the peripheral blood of healthy women.The miR-21 and miR-155 obtained were detected by real time quantitative PCR.Then the relationship between the trend of miR-21 and miR-155 in serum and in tumor tissues was analyzed.ResultsThe expression levels of miR-21and miR-155 in adjacent tissues of breast cancer patients were significantly lower than those in tumor tissues.The expression levels of miR-21 and miR-155 in the serum of breast cancer patients were significantly higher than those of healthy women.ConclusionThe levels ofserum miR-21 and miR-155 can be used asbiomarkers forthe early diagnosisofbreastcancer.

MicroRNA;Breast cancer;Tumor marker;miR-21;miR-155

R737.9

A

1003—6350（2012）18—001—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.18.001

2012-03-11)

卞國(guó)奉(1985—)，男，湖北省宜昌市人，住院醫(yī)師，碩士。

*通訊作者：陳愛(ài)軍(1964—)，男，湖北省宜昌市人，碩士生導(dǎo)師，教授，研究方向：普外腫瘤。E-mail:chenaijun@163.net