袁冬蘭，錢華

（泰州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇泰州225300）

宮頸疾病患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞的檢測(cè)及臨床意義

袁冬蘭，錢華

（泰州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇泰州225300）

目的檢測(cè)宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞的表達(dá)，分析其臨床意義。方法熒光抗體CD127-FITC、CD4-PECY5、CD25-PE標(biāo)記T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定50例宮頸癌患者和49例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組[n=33，(8.07±2.18)%]比較，宮頸癌組[n=50，(11.15±1.97)%]、宮頸上皮內(nèi)瘤變組[n=49，(10.61±2.62)%]CD4+CD25+CD127-/low均顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001）；與宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)組[n=16，(8.96±0.65)%]比較，宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ級(jí)組[n=33，(11.54±2.72)%]顯著升高，兩者比較有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.114，P＜0.001）；與宮頸癌Ⅰ期組[n=20，(10.34±1.79)%]比較，宮頸癌Ⅱ期組[n=30，(11.68±1.97)%]顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 2.424，P＜0.05）。結(jié)論外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞的表達(dá)升高可能在宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)病的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用。

宮頸癌；宮頸上皮內(nèi)瘤變；CD4+CD25+CD127-/lowTreg

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性腫瘤的第2位。全世界每年有20多萬女性死于宮頸癌。研究表明，腫瘤的發(fā)生與機(jī)體免疫逃避有關(guān)[1]，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)具有免疫無能性和免疫抑制性，是腫瘤免疫抑制的重要途徑之一。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫抑制特性的T淋巴細(xì)胞亞群，在外周免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[2]。該細(xì)胞亞群能夠抑制自身免疫病的發(fā)生，參與腫瘤免疫的調(diào)節(jié)。我們對(duì)宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變患者外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞進(jìn)行研究，分析其在宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，用CELLQuest軟件（BD公司）獲取和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。鞘液用Systmex公司的Cellpack血細(xì)胞稀釋液。

1.1.2 試劑CD4-PeCy5(Code No：MHCD0406)、CD25-PE(Code No：MHCD2504)及其同型對(duì)照Mouse IgG1-PE(Code No：MG104)由Invitrogen公司提供；CD127-FITC(Clone：Ebiordr5)和同型對(duì)照Mouse IgG1-FITC k Isotype Control(clone：P3)由eBioscience公司提供。

1.1.3 研究對(duì)象選取2010年1～12月在我院初診的宮頸癌患者50例(宮頸癌組)，年齡31～75歲，平均(50±7)歲；宮頸上皮內(nèi)瘤變患者49例(宮頸上皮內(nèi)瘤變組)，年齡28～54歲，平均(42±6)歲。另選擇我院健康體檢健康志愿者33例(正常對(duì)照組)，年齡25～58歲，平均(35±8)歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本準(zhǔn)備受試者均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周靜脈血EDTA-K2抗凝2 ml，標(biāo)本在6 h之內(nèi)測(cè)定。

1.2.2 CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞的測(cè)定將試管分為兩組，測(cè)定管加入CD4-PeCY5和CD25-PE各5μl、CD127-FITC 20μl，對(duì)照管加入CD4-PeCY5和Mouse IgG1-PE各5μl、Mouse IgG1-FITC 20μl；將標(biāo)本充分混勻，分別加50 ml EDTA-K2抗凝血于上述兩組試管中，震蕩器上充分混勻，避光放置15 min；加入溶血素2 ml，充分震蕩，避光放置10 min。1 500 rpm離心5 min棄上清，加入生理鹽水2 ml震蕩，1 500 rpm離心5 min棄上清，加入生理鹽水100μl，充分震蕩混勻，待測(cè)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀器設(shè)置及數(shù)據(jù)分析用FACSComp調(diào)整儀器FSC、SSC、FL1、FL2、FL3的電壓及補(bǔ)償。用CELLQuest軟件獲取20 000個(gè)淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析。選取CD4+細(xì)胞進(jìn)行分析，分別以同型對(duì)照管調(diào)整Marker的位置。在同等的實(shí)驗(yàn)條件下，用以分析測(cè)定管中CD4+CD25+CD127-/lowT細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例（見圖1）。

圖1 CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞測(cè)定圖

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用sigmastat3.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，文中正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。兩組樣本間正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組樣本間采用One Way ANOVO的單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸上皮內(nèi)瘤變患者、宮頸癌患者及正常對(duì)照組外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞比較結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組[n=33，(8.07±2.18)%]比較，宮頸癌組[n=50，(11.15±1.97)%]、宮頸上皮內(nèi)瘤變組[n= 49，(10.61±2.62)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞均顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001）。而宮頸癌組和宮頸上皮內(nèi)瘤變組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.161，P=0.249）。

2.2 宮頸上皮內(nèi)瘤變患者不同分期患者組外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞比較結(jié)果顯示，與宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)組[n=16，(8.96±0.65)%]比較，宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ級(jí)組[n=33，(11.54±2.72)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.114，P＜0.001）。

2.3 宮頸癌不同分期患者組外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞比較結(jié)果顯示，與宮頸癌Ⅰ期組[n=20，(10.34±1.79)%]比較，宮頸癌Ⅱ期組[n=30，(11.68±1.97)%]CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞顯著升高，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.424，P＜0.05）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與人體的免疫功能密切相關(guān)，T淋巴細(xì)胞在其中起了尤其重要的作用[1]。Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制特性的T淋巴細(xì)胞亞群，在外周免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[2]。Treg細(xì)胞根據(jù)表面標(biāo)志、分泌的細(xì)胞因子及發(fā)揮作用的方式，可分為多種亞群，主要包括CD4+CD25+天然Treg、Ⅰ型Treg (Tr1)及Th3。CD4+CD25+Treg起源于胸腺，并作為一個(gè)獨(dú)立的T細(xì)胞亞群在胸腺發(fā)育、分化和成熟。近年來CD4+CD25+Treg的分子標(biāo)志也已逐漸被識(shí)別，其高水平表達(dá)IL-2αR(CD25)、CTLA-4、GITR、CIM4、CD45等分子，而低表達(dá)CD45RB分子[3]。最初選用高表達(dá)CD25（CD25hi）的細(xì)胞群作為對(duì)CD4+CD25+Treg的界定方法。這樣得到的Treg細(xì)胞不準(zhǔn)確，因?yàn)榻?jīng)免疫激活的效應(yīng)性T細(xì)胞CD25的表達(dá)也會(huì)上調(diào)，使之很難區(qū)分Treg細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子FoxP3在天然Treg細(xì)胞發(fā)育及功能維持中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[4]。許多學(xué)者采用Foxp3轉(zhuǎn)錄因子作為Treg細(xì)胞內(nèi)的特征性標(biāo)志物[5]。但FoxP3為胞內(nèi)蛋白，該方法需要固定、穿孔、染色，操作繁瑣，難以在臨床和科研中推廣。我們?cè)谇捌谘芯匡@示，CD4+CD25highCD127low亞群主要是表達(dá)FOXP3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25high FOXP3+Treg)，CD4+CD25+CD127-/low細(xì)胞亞群與可以較準(zhǔn)確反映CD4+CD25high FOXP3+Treg細(xì)胞的數(shù)量[6]。因此我們用CD4+CD25+CD127-/low的界定方法對(duì)宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者外周血細(xì)胞Treg進(jìn)行定義分析。結(jié)果顯示：宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均顯著高于正常對(duì)照人群，可能是CD4+CD25+CD127-/lowTreg升高使機(jī)體免疫系統(tǒng)受抑制，監(jiān)視體內(nèi)突變細(xì)胞能力下降。提示CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞的表達(dá)升高可能在宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)病中起重要作用。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫監(jiān)視功能有非常密切的關(guān)系。機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能不僅能抑制自身免疫性疾病發(fā)生，還可能參與腫瘤免疫的調(diào)節(jié)。腫瘤的免疫逃逸機(jī)制之一是Treg細(xì)胞對(duì)抗腫瘤免疫的抑制作用。目前許多研究顯示多種腫瘤患者外周血和腫瘤部位可發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量和比例增加[7-8]。我們對(duì)不同分期的宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞進(jìn)行分析顯示：宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ級(jí)患者。宮頸癌Ⅰ期患者CD4+CD25+CD127-/lowTreg均顯著高于宮頸癌Ⅱ期患者。提示CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞可能與宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變的分期、分級(jí)相關(guān)。說明外周血CD4+CD25+CD127-/lowTreg細(xì)胞的表達(dá)升高可能在宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)病的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定作用。但其在宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)病的療效觀察和預(yù)后評(píng)估中的作用如何還有待進(jìn)一步研究。

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Detection of the expression of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in peripheral blood in patients with cervix diseases and its clinical significance.

YUAN Dong-lan,QIAN Hua.Department of Gynecology&Obstetrics,People's Hospital of Taizhou City,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in peripheral blood in patients with cervix cancer and cervical intraepithelial neoplasia(CIN),and to explore its clinical significance.Methods T cells were marked with fluorescence antibody CD127-FITC,CD4-PECY5,CD25-PE.The levels of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells were detected by flow cytometry in 50 patients with cervix cancer(group A),49 patients with CIN(group B),and 33 healthy individuals(the control group).ResultsCompared with the control group[(8.07±2.18)%],the levels of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in group A[(11.15±1.97)%]and group B[(10.61±2.62)%]were significantly higher(t=6.018，P＜0.001；t=4.943，P＜0.001).The level of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in patients with CIN of gradeⅡ～Ⅲ[n=33,(11.54±2.72)%]was significantly higher than that in patients with CIN of gradeⅠ[n=16,(8.96±0.65)%], with t=4.114 and P＜0.001.The level of CD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in patients with cervix cancer of stageⅡ[n=30, (11.68±1.97)%]was significantly higher than that of patients with cervix cancer of stageⅠ[n=20,(10.34±1.79)%], with t=2.424 and P＜0.05.ConclusionCD4+CD25+CD127-/lowTreg cells in the peripheral blood might play an important role in the development and progression of cervix cancer and CIN.

Cervix cancer;Cervical intraepithelial neoplasia;CD4+CD25+CD127-/lowTreg

R446.61

A

1003—6350（2012）04—011—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.04.004

2011-09-06）

袁冬蘭（1973—），女，江蘇省泰州市人，副主任醫(yī)師，學(xué)士。