李榮富，李欣，吳姍珊，高廣周，孫濤

(1.第二軍醫(yī)大學海軍臨床學院，北京 100048;2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100048;3.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院放療科，北京 100048;4.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院中心實驗室，北京 100048)

腹膜后淋巴結轉移癌在臨床上較常見，多由消化系統(tǒng)惡性腫瘤轉移而來，易導致患者腹痛或腰背部疼痛等不適，使患者生活質(zhì)量下降。近年來，γ刀放療已成為腹膜后淋巴結轉移癌的主要選擇之一，其止痛效果良好，且能有效殺滅局部腫瘤細胞。然而，局部γ刀放療是否影響腸道菌群的平衡目前尚不十分清楚。本研究選擇了海軍總醫(yī)院2010年4月至2011年1月間采用γ刀放療的腹膜后淋巴結轉移癌患者作為觀察組，監(jiān)測其腸道菌群變化，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究對象為經(jīng)臨床表現(xiàn)及影像學、病理學確診的腹膜后淋巴結轉移癌并擬行γ刀放療的40例患者，男24例，女16例，年齡(59.7±15.4)歲。由于不同年齡和性別患者腸道菌群可能有差異，我們選擇與患者年齡、性別相匹配的20例健康志愿者為對照組，男13例，女7例，年齡(55.6±17.8)歲。觀察組及正常對照組人員在入選前6周內(nèi)、放療期間及放療結束后1個月內(nèi)均未使用過任何抗生素及腸道微生態(tài)制劑，入選前查糞便常規(guī)正常，且無腹瀉、腹脹、便秘等腸道菌群紊亂表現(xiàn)。

1.2 主要儀器和試劑

OUR-QGD型體部γ刀，熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad);標準菌株:長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌標準菌株(源自中國科學院微生物所菌種保藏中心)，大腸桿菌及糞腸球菌標準菌株(源自海軍總醫(yī)院檢驗科微生物室);主要試劑:Taq Plus PCR Master-Mix、Real Master Mix、SYBR solution、TI ANamp Bacteria DNA Kit(北京天根生物技術公司)。

1.3 放療方法

觀察組40例患者均采用OUR-QGD型體部伽瑪?shù)吨委煛；颊咂脚P于定位床，內(nèi)置負壓袋，抽真空固定軀體，CT 3～5 mm層距掃描病灶，將獲得的圖像和相關數(shù)據(jù)輸入治療計劃系統(tǒng)，以55%～70%等劑量包繞計劃靶區(qū);劑量為3.0～4.5 Gy·次－1，放療次數(shù)為10～11次，總放射劑量為30.8～49.5 Gy，前4次為隔日治療，后為連續(xù)治療。

1.4 糞便標本采集

觀察組患者留取放療前、放療結束后1周及1個月清晨糞便，對照組留取清晨糞便1次。每次留取糞便標本0.4 g以上，采取無菌玻璃瓶留存;所留取標本于2 h內(nèi)放入－80℃低溫冰箱保存待檢。

1.5 細菌DNA測定

1.5.1 標準菌株及糞便標本DNA提取 取標準菌株長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、大腸桿菌、糞腸球菌凍干粉(均為0.2 g)，用TIANamp Bacteria DNA試劑盒提取標準菌株DNA。取0.2 g糞便標本用DNA緩沖液處理后，取上清200 μl同法提取糞便細菌基因組DNA。提取后的標準菌株DNA及糞便基因組DNA樣品均于－20℃冰箱保存。

1.5.2 PCR引物設計 參照Rinttila等［1］報道方法，根據(jù)長雙歧桿菌、酸酸乳桿菌、大腸桿菌、糞腸球菌16S rDNA基因序列設計雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、腸球菌屬的菌屬特異PCR引物和大腸桿菌菌種特異PCR引物(表1)，并在BLAST基因庫內(nèi)比對引物序列的特異性。

表1 4種目標菌特異性引物Tab 1 Specific primers of four kinds of target species

1.5.3 引物特異性檢測 取1名正常對照者的糞便DNA與4種標準菌株DNA進行常規(guī)PCR反應。以100 bp DNA梯為標準，用1.0%瓊脂糖凝膠分析PCR擴增產(chǎn)物。

1.5.4 標準品的制備、濃度測定及拷貝數(shù)計算 以各標準菌株PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠、回收后所得的DNA片段作為熒光定量PCR的標準品，用紫外分光光度計測定其OD值，并記錄由系統(tǒng)計算出的DNA濃度。根據(jù)公式，分別計算每一標準品PCR片段的拷貝數(shù)。

1.5.5 標準曲線制作 將各標準品作10倍稀釋，使之成為1×107～1×102拷貝·μl－1，作為標準品，進行SYBR Green為熒光染料的實時定量PCR反應。反應完畢后進行溶解曲線分析，從60℃開始，直到95℃，以0.5℃間隔逐漸加熱，每一遞增溫度保持10 s以讀取溶解曲線熒光數(shù)據(jù)。根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件 iCycler Optical System Interface Software(v2.0，Bio-Rad)自動分析Ct值，并產(chǎn)生標準曲線。

1.5.6 待測糞便樣品 16S rDNA的定量分析，將待測糞便樣品中提取的DNA分別進行4種細菌的16S rDNA熒光定量PCR反應，反應體系和反應條件與標準曲線制備時相同。每次實驗同時設標準品校正和ddH2O代替DNA模板的陰性對照，每個樣品均同時做3個平行復孔。反應完畢后根據(jù)溶解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。

1.6 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以±s表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 引物特異性鑒定

用1.0%瓊脂糖凝膠分析各標準菌株及對照者糞便標本的16S rDNA常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物，以100 bp DNA Ladder為標準。結果可見4種標準菌株PCR擴增產(chǎn)物均顯示出特異性條帶;正常對照組糞便標本DNA擴增產(chǎn)物除目的條帶外，未見明顯非特異性區(qū)帶(如圖1)。提示各菌種引物特異性好，可用于實時熒光定量PCR反應。

圖1 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 1 The electrophoresis of 16S rDNA PCR products

2.2 標準品基因組DNA濃度的測定

分別測定各標本的OD值，并由系統(tǒng)自動計算出雙鏈DNA濃度。每份標本均檢測3次，取其平均值。標準菌株的DNA濃度中長雙歧桿菌為55 ng·μl－1，大腸桿菌為 48 ng·μl－1，糞腸球菌為 39 ng·μl－1，酸酸乳桿菌為 46 ng·μl－1。

2.3 擴增曲線

各標準品10倍稀釋后進行實時熒光定量PCR反應，可得到模板循環(huán)數(shù)與熒光強度關系圖(圖2)。從圖中可以看出不同拷貝數(shù)的模板隨循環(huán)數(shù)的增加，其熒光強度逐漸增加，在經(jīng)過一段指數(shù)擴增期后曲線趨于平行，指數(shù)擴增期模板拷貝數(shù)與熒光累積值的對應關系形成了定量的基礎。

2.4 標準曲線

以不同拷貝數(shù)的標準品的對數(shù)為縱坐標，以定量PCR反應過程中達到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為橫坐標，得到各細菌的標準曲線，為待測樣品的定量提供了參考標準。標準曲線見圖3。

2.5 溶解曲線

每次定量PCR反應完畢后進行溶解曲線分析，可見溶解曲線均為單峰，說明擴增產(chǎn)物單一，與SYBR Green熒光染料結合的為目的DNA片段，避免了定量PCR檢測過程中假陽性結果的出現(xiàn)，溶解曲線見圖4。

圖2 4個目標菌群標準品實時熒光定量PCR擴增曲線圖Fig 2 The Real-time PCR amplification curves of four kinds of target bacteria standards

圖3 4個目標菌群標準曲線圖Fig 3 The standard curve of four kinds of target bacteria

2.6 糞便標本的細菌定量

4種糞便細菌定量的結果見表2～5。由表2～5可見，與對照組相比，觀察組患者γ刀放療前及放療后1周糞便中4種腸道目標菌群無明顯變化(P＞0.05)，放療后1個月，糞便中大腸桿菌及腸球菌屬細菌數(shù)量仍無顯著變化(P＞0.05)，但雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬細菌數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。

圖4 4個目標菌群溶解曲線圖Fig 4 The dissolution curve of four kinds of target bacteria

表2 γ刀放療前后糞便標本大腸桿菌定量結果(±s) LogN·(g濕便)－1Tab 2 The quantitative results of stool specimens of E.coli( ± s) LogN·(g wet stool)－1

表2 γ刀放療前后糞便標本大腸桿菌定量結果(±s) LogN·(g濕便)－1Tab 2 The quantitative results of stool specimens of E.coli( ± s) LogN·(g wet stool)－1

組 別 n 細菌定量放療前 放療后1周 放療后1個月正常對照組 20 9.16±1.15— —觀察組 40 9.23 ±0.98 8.99 ±1.13 9.35 ±1.05 t值0.245 －0.535 0.644 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表3 γ刀放療前后糞便標本腸球菌屬細菌定量結果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 3 The quantitative results of stool specimens of Enterococcus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

表3 γ刀放療前后糞便標本腸球菌屬細菌定量結果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 3 The quantitative results of stool specimens of Enterococcus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

組 別 n 細菌定量放療前 放療后1周 放療后1個月正常對照組 20 8.04±0.86— —觀察組 40 8.19 ±0.84 8.00 ±0.62 8.22 ±0.85 t值0.919 0.185 1.019 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表4 γ刀放療前后糞便標本雙歧桿菌屬細菌定量結果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 4 The quantitative results of stool specimens of Bifidobacterium genus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

表4 γ刀放療前后糞便標本雙歧桿菌屬細菌定量結果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 4 The quantitative results of stool specimens of Bifidobacterium genus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

組 別 n 細菌定量放療前 放療后1周 放療后1個月正常對照組 20 9.07±0.77— —觀察組 40 9.15 ±0.76 9.13 ±0.91 8.11 ±1.36 t值0.388 0.291 －2.926 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05

表5 γ刀放療前后糞便標本乳酸桿菌屬細菌定量結果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 5 The quantitative results of stool specimens of Lactobacillus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

表5 γ刀放療前后糞便標本乳酸桿菌屬細菌定量結果( ±s) LogN·(g 濕便)－1Tab 5 The quantitative results of stool specimens of Lactobacillus( ± s) LogN·(g wet stool)－1

組 別 n 細菌定量放療前 放療后1周 放療后1個月正常對照組 20 8.80±1.01— —觀察組 40 8.71 ±0.94 8.84 ±0.94 7.99 ±1.23 t值 －0.358 0.144 －2.386 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05

3 討 論

腸道菌群構成腸道的生物屏障，它是人體微生態(tài)學的重要組成部分，也是最大最復雜的微生態(tài)系。腸道細菌達400～500種，總量有1 014個集落形成單位，相當于人體體細胞數(shù)量的10倍［2］。細菌約占正常成人糞便重量的60%，其中80%由6種主要細菌組成，包括擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬及腸桿菌屬，每個菌屬均包括許多菌種［3］。糞便標本常用于研究結腸菌群，主要代表遠端結腸的腔內(nèi)環(huán)境［4］。隨著分子生物學理論和技術的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了許多非培養(yǎng)依賴的新方法用于檢測腸道菌群，其中基于16S rDNA基因序列分析技術就是其中較常用的一種方法。

16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的DNA序列，其堿基序列含進化速度不同的可變區(qū)和保守區(qū)。保守區(qū)在進化過程中保持穩(wěn)定，某些序列片段為所有細菌所共有。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已知的不同細菌的16S rDNA序列設計特異性引物，就可應用實時熒光定量PCR技術檢測樣本中細菌基因組16S rDNA的拷貝數(shù)。本實驗中所采用的熒光染料為SYBR Green，它可與雙鏈DNA嵌入性結合，該方法可用性高，操作較為簡便，且費用較低。實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加［5］。從而利用熒光強度的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，實現(xiàn)對未知模板進行定量的一種方法。對模板進行定量的方法可分為絕對定量和相對定量兩種。絕對定量方法是用一系列已知濃度的標準品作為模板進行PCR反應，以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以測得的Ct值作為縱坐標，制作標準曲線，繼而在相同的條件下對未知樣品進行PCR反應，測得樣本 Ct，即可在標準曲線中得到樣品的拷貝數(shù)［6］。相對定量是利用一定樣本中的靶序列與另一參照樣本的量的比較，最常見的參照看家基因(又稱管家基因)有 GAPDH、β-actin、18SRNA 和 28SRNA［7］等。本研究采用的是絕對定量方法。

本研究中應用以16S rDNA為基礎的實時熒光定量PCR法，對已行γ刀放療患者的腸道菌群進行定時監(jiān)測，結果顯示，γ刀放療后1個月腸道雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬細菌數(shù)量較正常對照組明顯減少，而大腸桿菌及腸球菌屬細菌數(shù)量無明顯變化。γ刀放療結束后1周患者腸道菌群無明顯變化，放療結束后1個月腸道內(nèi)大腸桿菌及腸球菌屬細菌數(shù)量仍無明顯改變，其原因考慮有:(1)體部γ刀放療作為當前一種治療晚期惡性腫瘤的手段，與既往普通放療方式不同，作用范圍小，采用旋轉野照射，在對正常組織損傷小的同時對腸道菌群影響也較小;(2)γ刀放療作用主要集中于已有癌細胞轉移的淋巴結，而位于腫瘤周圍腸管不斷蠕動，導致單位腸道面積接受放射劑量小，相應腸道上皮細胞損傷較輕，腸道細菌定居環(huán)境無明顯受損，同時腸道內(nèi)細菌直接接受的放射劑量較小，不足以殺滅細菌;(3)放射線的治療作用在一定程度上主要依靠后效應，因此，在放療期間以及放療結束后1周內(nèi)局部放射線作用發(fā)揮不完全;(4)本研究跟蹤標本時間較短，僅1個月，腸道內(nèi)大腸桿菌及腸球菌屬細菌數(shù)量是否會在1個月后上升仍需進一步研究。γ刀放療結束1個月后，腸道內(nèi)益生菌數(shù)量明顯減少，考慮為γ刀放療遠后效應使腸道菌群定居生存環(huán)境發(fā)生改變及直接殺死腸道益生菌所致;而大腸桿菌及腸球菌數(shù)量無明顯變化，考慮為一方面放療遠后效應直接或間接殺死部分大腸桿菌及腸球菌屬細菌，另一方面為腸道益生菌數(shù)量減少，有利于大腸桿菌及腸球菌屬細菌數(shù)量的增長，造成消減與增長互相抵消。放射線導致腸道菌群失調(diào)機制［8］為:(1)放射線損傷宿主的腸上皮細胞的表面結構，從而使腸道原籍菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌不能穩(wěn)定定居于上皮細胞表面或黏蛋白層上。(2)放射線直接殺滅、抑制、擾亂腸道正常菌群;(3)放射性腸炎患者腸蠕動減慢、淤滯、微絨毛受損，導致腸道清除能力下降，繼而導致菌群紊亂。腸道益生菌具有直接抗致病微生物作用:主要通過降低腸道定植、抑制致病菌與腸道上皮細胞結合、抑制致病菌侵入腸上皮細胞、促進腸上皮細胞分泌β防御素及促進腸道sIgA的分泌［9］而產(chǎn)生。乳酸桿菌屬及雙歧桿菌屬細菌等原籍菌減少可使腸道通透性明顯增高，而小腸通透性增高使水、鈉吸收減少產(chǎn)生腹瀉;另一方面可使腸黏膜免疫系統(tǒng)過多暴露于腸腔內(nèi)的抗原而活化，使肥大細胞數(shù)目增多、細胞因子水平升高，而后兩者對胃腸道動力和分泌功能均有影響。菌群失調(diào)可能導致結腸內(nèi)食物殘渣酵解異常，從而使酵解產(chǎn)物包括短鏈脂肪酸、其他有機酸、乙醇、二氧化碳和甲烷的量發(fā)生變化，引起腹脹、腹痛等癥狀［10］，提高了腸源性感染的風險。根據(jù)既往報道［11］，放療后腸腔內(nèi)大腸桿菌及腸球菌屬細菌數(shù)量增加。

本觀察結果提示，γ刀放療期間及放療結束后1周內(nèi)患者腸道菌群較穩(wěn)定，因此，在γ刀放療期間及放療結束后1周內(nèi)無需過多干預調(diào)節(jié)腸道菌群。而在γ刀放療結束后1個月內(nèi)即可出現(xiàn)腸道益生菌如雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬細菌數(shù)量減少，出現(xiàn)輕微的腸道菌群紊亂。由于放療通過損傷腸黏膜屏障和改變腸內(nèi)環(huán)境，使腸道內(nèi)革蘭陰性菌優(yōu)勢繁殖，益生菌數(shù)量減少，發(fā)生菌群失調(diào)。與此同時，細菌內(nèi)毒素可經(jīng)門靜脈大量進入體循環(huán)而形成腸源性內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素血癥反過來又可使胃腸功能紊亂、肌張力下降、腸蠕動減弱、毛細血管通透性增加，導致大量炎性物質(zhì)滲出，從而加重腸黏膜的損傷程度，進一步加劇腸道細菌移位和內(nèi)毒素吸收，形成惡性循環(huán)［12］。因此，預防治療γ刀放療患者出現(xiàn)的腸道菌群紊亂至關重要。然而，由于放療的遠后效應，關于使用腸道微生態(tài)制劑能否有效調(diào)劑腸道菌群，何時使用腸道微生態(tài)制劑以及使用何種腸道微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)腸道菌群最為有效仍需進一步研究。

［1］RINTTILA T，KASSINEN A，MALINEN E，et al.Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers for quantification of pathogenic and indigenous bacteria in faecal samples by samples by real-time PCR［J］.J Appl Microbiol，2004，97(6):1166-1177.

［2］韓曉云，鄧紅，蔡燕.腸道微生物與慢性病［J］.中國微生態(tài)雜志，2009，11(21):1039-1042.

［3］SGHIR A，GRAMET G，SUAU A，et al.Quantification of bacterial groups within human fecal flora by oligonucleotide probe hybridization［J］.Appl Environ Microbiol，2000，66(5):2263-2266.

［4］HILL M J，DRASAR B S.The normal colonic bacterial flora［J］.Gut，1975，16(4):318-323.

［5］朱捷，楊成君，王軍.熒光定量PCR技術及其在科研中的應用［J］.生物技術通報，2009，(2):73-76.

［6］WONG M L，MEDRANO J F.Real-time PCR for mRNA quantitation［J］.Biotechniques，2005，39(1):75-85.

［7］GALBIATI S，SMID M，GAMBINI D，et al.Fetal DNA detection in material plasma throughout gestation［J］.Hum Genet，2005，177(2-3):243-248.

［8］彭波，陳思瑋.放射性腸炎患者腸道菌群的變化及雙歧三聯(lián)活菌制劑的療效研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2000，10(10):85-86.

［9］管遠志.腸道菌群及其生物學意義［J］.臨床兒科雜志，2009，27(11):1095-1097.

［10］NOBAEK S，JOHANSSON M L，MOLIN G，et al.Alteration of intestinal microflora is associated with reduction in abdominal bloating and pain in patients with irritable bowel syndrome［J］.Am J Gastroenterol，2000，95(5):1231-1238.

［11］ALEXANDER J W，GIANOTTI L，PYLES T，et al.New insights into the pathogenesis of radiation-induced intestinal dysfunction［J］.Aliment Pharmacol Ther，2000，14(5):523-528.

［12］KAO M S.Intestinal complications of radiotherapy in gynecologic malignancy-clinical presentation and management［J］.Int J Gynecol Obstet，1995，49(Suppl):S69-75.