李彩虹，彭罡，周克元

(廣東醫(yī)學院 1.生物化學與分子生物學教研室;2.醫(yī)學活性分子研究重點實驗室;3.中藥新藥研究所，廣東 東莞 523808)

黃連為毛茛科植物黃連(coptis chinensis franch)、三角葉黃連(Coptis deltoideaC.Y.Chen et Hsiao)或云連(Coptis teetaWall1.)的干燥根莖，主要含有小檗堿、黃連堿、藥根堿、甲基黃連堿等生物堿成分，其中以小檗堿含量最高［1］。《中國藥典》(2005年版)中測定黃連中小檗堿含量的方法主要為薄層色譜法［2］。此外，采用高效液相色譜(HPLC)法可更加精確鑒定黃連中鹽酸小檗堿及其含量。

鹽酸小檗堿(Berberine)為非處方藥，具有廣泛的藥理作用。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在體外該類化合物濃度在每毫升微克級水平時，可抑制人白血病K562細胞、食管癌 YES細胞、肝癌 HepG2細胞、結(jié)腸癌colon26/colon20細胞、人早幼粒白血病HL-60細胞、人胃癌SGC-7901細胞、鼻咽癌CNE-2Z細胞等多種腫瘤細胞的生長，促進人早幼粒白血病HL-60細胞、人胃癌細胞MGC-803和SGC-7901的分化，誘導人胃癌MGC-803和 BGC823細胞凋亡［3］，促進 Hela細胞凋亡［4］。作者首次使用反向高效液相色譜(RP-HPLC)法測定黃連中鹽酸小檗堿的含量，為控制黃連藥材、黃連提取物中間固體和鹽酸小檗堿片的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀，廣東醫(yī)學院色譜工作站。黃連藥材購于重慶西部制藥有限責任公司中藥分公司(生產(chǎn)許可證號:渝Y20060117)，鹽酸小檗堿系廣東醫(yī)學院醫(yī)學活性分子研究重點實驗室從黃連藥材中提取分離，鹽酸小檗堿標準品(供含量測定用，編號110713-200911，由中國藥品生物制品檢定所提供)，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，磷酸、三乙胺等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Luna C18柱(150 mm×4.60 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(25 ∶75)，每 1 000 ml 0.1%的磷酸溶液中加入50 μl的三乙胺(掃尾劑)進行洗脫，流速為 1 ml·min－1，檢測波長為 340 nm，柱溫為25℃，進樣量為10 μl，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰面積計算應不低于3 000積分。

2.2 標準曲線

精密稱取鹽酸小檗堿對照品12.30 mg，置50 ml量瓶中，加入甲醇，超聲15 min溶解，并稀釋至刻度，即配制濃度為 246.0 μg·ml－1的對照品貯備液。對照品貯備液設進樣量為 1、2、3、5、7、10 μl，依次注入色譜儀，測定峰面積，以鹽酸小檗堿對照品含量(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。進行線性回歸，得回歸方程。鹽酸小檗堿回歸方程及線性系數(shù)見圖1，鹽酸小檗堿含量在0.246 ～2.460 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 鹽酸小檗堿標準曲線圖Fig 1 The standard curve of BH

2.3 供試品制備

酸性水溶劑煎煮法提取黃連中的鹽酸小檗堿，再利用熱蒸餾水溶解，抽濾，重結(jié)晶，最后用無水乙醇溶解，抽濾，重結(jié)晶(無水乙醇重結(jié)晶法重復3次)，得鹽酸小檗堿精制品［5］。取精制樣品適量，研細，精密稱取6.3 mg，置容量瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，過濾，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，即得。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品貯備液，按上述色譜條件連續(xù)進樣5次，測得峰面積及相對標準偏差(RSD)結(jié)果見表1，鹽酸小檗堿峰面積的RSD=0.41%，表明儀器精密度良好。

表1 鹽酸小檗堿峰面積及RSDTab 1 Peak area and RSD results of BH

2.5 陰性試驗

制備鹽酸小檗堿陰性試液，依所給色譜條件操作，得色譜圖，與對照品、供試品色譜圖比較，結(jié)果見圖2。表明在鹽酸小檗堿峰處(T=7.88 min)無干擾。

圖2 鹽酸小檗堿陰性試驗圖譜Fig 2 HPLC chromatograms of negative test of BH

2.6 重現(xiàn)性試驗

分別制備供試品溶液6份，根據(jù)同樣色譜條件，取10 μl進樣，測得峰面積及RSD，結(jié)果見表2。鹽酸小檗堿峰面積的RSD=0.27%，表明方法精密度良好。

表2 鹽酸小檗堿峰面積及RSDTab 2 Peak area and RSD results of BH

2.7 穩(wěn)定性試驗

供試品溶液分別在 0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 測定，測得峰面積及RSD，結(jié)果見表3。鹽酸小檗堿峰面積的RSD=0.80%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表3 鹽酸小檗堿峰面積及RSDTab 3 Peak area and RSD results of BH

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知準確含量的同一樣品9份，分別精密加入上述對照品貯備溶液 0.75、1.0、1.2 ml，然后按供試品溶液的測定項下操作、測定，結(jié)果見表4。鹽酸小檗堿平均回收率 =100.1%，RSD=1.60%(n=9)，表明方法準確度良好。

表4 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗結(jié)果Tab 4 The recovery results of sample

2.9 樣品測定

吸取2.3項下供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，用外標法計算樣品中鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表5。所提取的鹽酸小檗堿的純度為87.62%。

表5 鹽酸小檗堿含量及RSDTab 5 The content and RSD results of BH

3 討 論

利用酸性水溶劑煎煮法提取中藥黃連中的小檗堿，并用重結(jié)晶精制法對鹽酸小檗堿粗品進行純化，可得到純度高達87.62%的鹽酸小檗堿。在0.246～2.460 μg范圍內(nèi)，鹽酸小檗堿含量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。實驗儀器精密度良好，本提取方法精密度和準確度良好，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

參照相關(guān)文獻［6-7］，本實驗曾采用甲醇-乙腈-0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉(20 ∶30 ∶50)，乙腈-1%磷酸(60∶40)洗脫液進行洗脫，分離出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象?，F(xiàn)有的研究中，也有加入掃尾劑來分析鹽酸小檗堿含量的方法，但都沒有對加入的掃尾劑進行定量。我們在不斷試驗摸索過程中發(fā)現(xiàn)，流動相采用乙腈-0.1%磷酸(25∶75)，每1 000 ml 0.1%的磷酸溶液中定量加入50 μl的三乙胺(掃尾劑)進行洗脫，分離效果較好，拖尾現(xiàn)象減弱，可快速測定黃連中鹽酸小檗堿的含量。將掃尾劑定量到50 μl加入流動相中后，用來測定鹽酸小檗堿的含量，可得到較好的分析結(jié)果，為準確、快速測定鹽酸小檗堿含量提供了參考。

［1］王慕鄒.常用中草藥高效液相色譜分析［M］.北京:科學出版社，1999:315-318.

［2］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)［S］.2005版.北京:化學工業(yè)出版社，2005:214.

［3］李波，朱維良，陳凱先.小檗堿及其衍生物的研究進展［J］.藥學學報，2008，43(8):773-787.

［4］YOUN M J，SO H S，CHO H J，et al.Berberine a natural product combined with cisplatin enhanced apoptosis through a mitochondria/caspase-mediated pathway in HeLa cells［J］.Biol Pharm Bull，2008，31(5):789-795.

［5］席國萍，宋國斌.黃連中小檗堿提取方法研究進展［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學，2009，37(1):8-10.

［6］李寶明，何麗一.高效液相色譜法測定霉滅滴膠囊中鹽酸小檗堿的含量［J］.藥物分析雜志，1999，19(6):128-129.

［7］楊廣民，歐陽榮，王宇紅，等.高效液相色譜法測定春雨燒傷膏中鹽酸小檗堿的含量［J］.湖南中醫(yī)學院學報，2004，24(4):20-22.