王曉兵，田國祥，張薇，張海娟

研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞通過合成和分泌多種多肽和蛋白質(zhì)產(chǎn)物參與調(diào)控凝血和纖溶，調(diào)節(jié)血管運動張力，控制血管平滑肌細胞增殖以及炎癥反應(yīng)過程等，是機體內(nèi)最富活性的細胞之一。血清皮質(zhì)酮（corticosterone）增多是機體應(yīng)激時的一個重要表現(xiàn)。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配、轉(zhuǎn)運和降解等過程，以維持細胞蛋白自穩(wěn)。但血清皮質(zhì)酮增多是否對主動脈內(nèi)皮細胞HSP有影響尚不十分清楚。本研究利用皮質(zhì)酮對大鼠主動脈內(nèi)皮細胞進行干預(yù)，旨在觀察皮質(zhì)酮對動脈內(nèi)皮細胞HSP70表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 健康Wistar大鼠（清潔級），體重（120±10）g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)動物所；皮質(zhì)酮購自Sigma 公司；抗HSP70抗體購自Santa Cruz 公司。Elx800 型酶標儀為BIO2TEK公司產(chǎn)品；倒置光學(xué)顯微鏡（BX60）為德國Leica 公司產(chǎn)品；PCR儀為Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 模型制做及分組 采用大鼠主動脈“環(huán)”植塊[1]進行大鼠主動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)及傳代。實驗用大鼠主動脈內(nèi)皮細胞隨機分為4組：正常組(未干預(yù)組，n=5)、皮質(zhì)酮干預(yù)量效組（包括3組）：0.1μ m 組（n=5）、50μM 組（n=5）和100μM 組（n=5）。量效組加入皮質(zhì)酮的終濃度分別為：0.1μM、50μ M 和100μ M ，再繼續(xù)培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、12 h、24 h和72 h后，收集細胞，作進一步實驗。

1.3 細胞總蛋白提取及蛋白含量測定 采用Bradford法[2]，以牛血清白蛋白（BSA）為測量標準蛋白質(zhì)，并將其配置成0.5 mg/ml。取5支EP管分別加入0.5 mg/ml BSA 5μl、10μl、15μl、20μl、25μ 1，再加0.15 mmol/L NaCl補足100μl；另取一支EP管加入100μl 0.15 mmo1/L NaCl，作為空白對照。然后，每支EP管中各加入1 ml考馬斯亮藍G-250染液，充分混勻，室溫下放置2 min，用1 cm光徑的比色杯測595 nm波長處的吸光度（A595），以A595與對應(yīng)的標準BSA濃度作標準曲線。再以同樣的方法測量待測蛋白樣品A595，對照標準曲線計算出樣品蛋白含量。

1.4 細胞總RNA的提取及RT-PCR 細胞總RNA的提?。簩⑹占募毎?ml Tripure，4℃，12000 g離心10 min，收集上清液。在室溫靜置勻漿上清液5 min。加0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 s。室溫放置（2～15）min。4℃，12000 g離心15 min。吸取上層無色水相，加入異丙醇0.5ml，顛倒數(shù)次，混合均勻。-20℃靜置15 min沉淀RNA。4℃，12000 g離心15 min，去上清液。加入1ml 預(yù)冷的75%酒精，洗滌沉淀。4℃，7500 g離心5 min，去上清液，37℃烤干沉淀。加入適量的DEPC處理過的消毒雙蒸水，重懸RNA并進行RNA定量。PCR引物設(shè)計與合成：從GenBank中查找大鼠HSP70和GAPDH基因序列，應(yīng)用Primer 4.0引物設(shè)計軟件，按照引物設(shè)計的基本原則，并優(yōu)選跨不同外顯子的一對引物。設(shè)計好的引物由上海生物工程公司合成。HSP70引物序列如下：上游引物：5'-GTT TCC TTC CTG CGA ACA CCT C-3'；下游引物5'-CCC AAC TAC AGC ACC ACC CTA C-3'。GAPDH引物序列如下：上游引物：5'-GTG ACT TCA ACA GCA ACT CCC ATT C-3'；下游引物：5'-GTT ATG GGG TCT GGG ATG GAA TTG TG-3'。

1.5 瓊脂糖電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物 用0.5×TBE電泳緩沖液配置1.5%瓊脂糖凝膠，微波爐溶膠后加入溴化乙錠使其終濃度為0.5 μg/ml，倒膠制板，取PCR產(chǎn)物15μl，加5μl DNA上樣緩沖液，混勻后上樣。5 V/cm正負極距離恒壓電泳，電泳完畢后，紫外透射儀下觀察電泳帶并照相。用Gel Doc 2000凝膠圖像分析儀對凝膠進行掃描和圖像分析：PCR產(chǎn)物量以積分光密度O Du×面積表示，以正常和干預(yù)后HSP70 PCR產(chǎn)物的測定值與內(nèi)參GAPDH測定值的比值來表示HSP70mRNA的相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間差異采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠主動脈內(nèi)皮細胞HSP70含量及量效動態(tài)變化 皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細胞2 h后，量效組（0.1μM組、50μM 組和100μM 組）內(nèi)皮細胞總蛋白中HSP70的含量顯示明顯增加；皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細胞4h后，各組內(nèi)皮細胞總蛋白中HSP70的含量達到峰值，其中以0.1μM 組HSP70的蛋白含量增加最為明顯。皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細胞72 h后，量效組內(nèi)皮細胞HSP70的蛋白含量仍有少量表達（圖1）。

2.2 皮質(zhì)酮干預(yù)4h后HSP70 mRNA的表達水平根據(jù)各組蛋白水平量效變化曲線，通過PCR重點檢測了正常組（未干預(yù)組）和0.1μM 組皮質(zhì)酮干預(yù)4 h大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中HSP70 mRNA水平。結(jié)果顯示，HSP70在正常情況下表達較弱，皮質(zhì)酮干預(yù)4 h后，其表達顯著提高（圖2）。

3 討 論

圖1 皮質(zhì)酮干預(yù)后大鼠主動脈內(nèi)皮細胞總蛋白中HSP70的含量及量效動態(tài)變化[A: 內(nèi)皮細胞總蛋白中HSP70量效動態(tài)變化；B: 0.1μ M組內(nèi)皮細胞總蛋白中HSP70的時間變化；C: 皮質(zhì)酮干預(yù)4 h各組內(nèi)皮細胞總蛋白中HSP70的含量]

圖2 皮質(zhì)酮干預(yù)4 h HSP70 mRNA的表達水平 [A：正常組和0.1μM 組HSP70 mRNA表達水平；B:：PCR擴增產(chǎn)物圖示]

在正常細胞中，熱休克蛋白作為分子伴侶有促進蛋白質(zhì)形成構(gòu)象、恢復(fù)已損傷蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和促進新多肽合成的作用[3]。而活性氧簇可對細胞大分子物質(zhì)如脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)造成損傷，乃至影響細胞的功能，所以有效的防護機制對于細胞生存非常重要。HSP參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配、轉(zhuǎn)運和降解等過程，以維持細胞蛋白自穩(wěn)，提高細胞對應(yīng)激原的耐受性，增強抗氧化作用，使細胞維持正常的生理功能[4,5]；HSP 70發(fā)揮這一作用的機制尚不清楚。已知HSP 70在應(yīng)激時高濃度地聚集在染色體及核質(zhì)內(nèi)，并以特殊的方式與解聚染色質(zhì)相互作用，防止染色質(zhì)和mRNA 復(fù)合物降解。研究表明[6]，HSP70或其含有羧基端部分的碎片具有保護細胞免受熱應(yīng)激損害的作用，表明HSP70對細胞的抗損傷能力至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)[7,8]熱休克預(yù)適應(yīng)對內(nèi)皮細胞應(yīng)激反應(yīng)的早期和延遲均有保護作用，能防止由于ATP 耗竭而導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞肌動蛋白破壞。培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）經(jīng)熱休克預(yù)適應(yīng)后，其HSP70mRNA的表達顯著增加，并能對抗隨后活性氧簇所致的損害，說明HSP70參與了熱休克誘導(dǎo)抗氧化損傷的保護作用。

在應(yīng)激條件下，生物細胞的應(yīng)激反應(yīng)強弱即應(yīng)激蛋白表達的量是通過一種自穩(wěn)機制來調(diào)節(jié)的。HSP70可通過HSF來調(diào)節(jié)各種應(yīng)激蛋白的合成，正常情況下細胞內(nèi)HSP70的含量是有限的，應(yīng)激強度的增加（如溫度的升高）可使其含量升高。HSP70具有多種底物識別結(jié)構(gòu)域和分子伴侶的功能。本研究采用皮質(zhì)酮干預(yù)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞后，觀測不同時相點和不同量效點大鼠主動脈內(nèi)皮細胞熱休克蛋白70表達的改變。結(jié)果顯示：不同濃度（0.1μM、50μM和100μM）的皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細胞2 h后，內(nèi)皮細胞總蛋白中HSP70的含量顯示明顯增加，皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細胞4 h后，各組內(nèi)皮細胞總蛋白中HSP70的含量達到峰值，其中以0.1μM 組HSP70的蛋白含量增加最為明顯。皮質(zhì)酮干預(yù)內(nèi)皮細胞72 h后，0.1μM組、50μM 和100μ M 組HSP70的蛋白含量仍有少量表達。提示皮質(zhì)酮可誘導(dǎo)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞HSP70表達，這種誘導(dǎo)作用在4 h達到峰值后隨時間延長作用逐漸減弱，至72 h基本消失，體現(xiàn)了皮質(zhì)酮通過HSP70表達增加參與內(nèi)皮細胞的保護。

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