郝卯林,戴雍月,倪世容,汪大望,李素娟,金可可△

(1.溫州醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,2.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,浙江溫州325035;3.中國(guó)人民解放軍第八二醫(yī)院內(nèi)分泌科,江蘇 淮安 223001)

近年資料表明,糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展不僅與整體血糖控制水平密切相關(guān),也與血糖波動(dòng)性有關(guān)。血糖波動(dòng)性越大,糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生率越高,預(yù)后越差[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者常見而嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥,高血糖導(dǎo)致的腎臟細(xì)胞凋亡參與糖尿病腎病的發(fā)生、進(jìn)展[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠血糖明顯波動(dòng)可加速腎小管上皮細(xì)胞凋亡[3]。業(yè)已證實(shí),血糖波動(dòng)更容易引發(fā)氧化應(yīng)激[4];JNK為絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的重要成員,JNK信號(hào)通路是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路。研究表明,高水平的活性氧能直接激活JNK,也能通過抑制磷酸酶、活化MAP3Ks等間接激活JNK[5]。因此,本研究旨在觀察JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在波動(dòng)性高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用,以探討波動(dòng)性高糖比穩(wěn)定性高糖引起更嚴(yán)重的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)及枸櫞酸鈉分析純購(gòu)于美國(guó)sigma公司;普通速效胰島素(400 U/10 ml)購(gòu)于江蘇萬邦生化有限公司;強(qiáng)生(Johnson)穩(wěn)步倍加血糖儀及試紙購(gòu)于美國(guó)強(qiáng)生;MDA和SOD試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;TUNEL試劑盒購(gòu)自Hoffmann-La Roche有限責(zé)任公司;非生物素標(biāo)記的即用型免疫組化二抗試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司;兔抗大鼠JNK、p-JNK單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;兔抗大鼠Nox4購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司;PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

180～220 g雄性SD大鼠由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照(A),其余采用STZ按65 mg/kg腹腔注射誘發(fā)糖尿病,注射STZ 72 h后,尾部取血,測(cè)空腹血糖和刺激大鼠膀胱測(cè)尿糖,血糖＞16.7 mmol/L,尿糖3個(gè)+以上為造模成功,隨機(jī)取DN大鼠分為穩(wěn)定高血糖組(B)和血糖波動(dòng)組(C),C組每天定時(shí)腹腔注射速效胰島素,并錯(cuò)時(shí)給予葡萄糖,造成1 d中血糖濃度大幅度波動(dòng)模型(圖 1)。12周 C組每天血糖波動(dòng)模式相似,且HbAlc在C組10.50%±0.69%與B組10.13%±0.96%比較無顯著性差異,提示波動(dòng)性高血糖造模成功。12周后取腎臟組織用于指標(biāo)測(cè)定。

Fig.1 Blood glucose variation curve of 3 groups

1.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

取腎組織勻漿,化學(xué)比色法測(cè)定SOD活性及MDA含量,操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 TUNEL法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡

檢測(cè)方法嚴(yán)格按說明書操作。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。計(jì)算5個(gè)高倍視野(×400)下的凋亡細(xì)胞數(shù),以凋亡細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞表示凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)。

1.5 免疫組化檢測(cè)腎臟Nox4和JNK蛋白表達(dá)

采用SABC法,DAB顯色。檢測(cè)方法嚴(yán)格按說明書操作。光鏡下觀察,陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞漿呈棕黃色染色,不染色者為陰性。

1.6 Western blot檢測(cè)腎臟JNK蛋白表達(dá)

細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后加裂解液,超聲裂解,吸取上清液,用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取10 μ g蛋白上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,封閉1.5 h,加入1∶1 000稀釋的P-JNK、JNK 抗體和GAPDH抗體(內(nèi)參),4℃過夜。Ⅰ抗反應(yīng)結(jié)束后,加1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性Ⅱ抗室溫孵育2 h,ECL試劑顯色并曝光成像,掃描并分析吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 波動(dòng)性高血糖對(duì)糖尿病大鼠的腎臟氧化應(yīng)激的影響

2.1.1 三組大鼠腎組織勻漿SOD活性和MDA含量的比較 與A組比較,B組和C組SOD活性明顯降低,且C組低于B組(P＜0.01);B組和C組MDA含量明顯升高,且C組高于B組(P＜0.01,表1)。

Tab.1 Comparison of the SOD activity andMDA content in renal tissue homogenate among different groups(±s,n=10)

Tab.1 Comparison of the SOD activity andMDA content in renal tissue homogenate among different groups(±s,n=10)

SOD:Soperoxideclismutase;MDA:Malonaldehyde*P＜0.05,**P＜0.01 vs normal control group;##P＜0.01 vs stable high blood glucose group

Group SOD(NU/ml) MDA(nmol/ml)Normal control 28.11±4.16 1.87±0.45 Stable high blood glucose 15.51±2.43** 3.72±0.74*Fluctuant high blood glucose7.77±1.61**##5.59±1.08**##

2.1.2 三組大鼠腎組織Nox4蛋白表達(dá)的比較 與A組和B組比較,C組腎小管上皮細(xì)胞Nox4蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖2見彩圖頁(yè)Ⅳ)。

2.2 波動(dòng)性高血糖對(duì)糖尿病大鼠的腎臟細(xì)胞凋亡的影響

A組腎小管上皮細(xì)胞幾乎未見凋亡細(xì)胞,B組(8.36%±2.66%)和C組(12.98%±2.81%)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,且C組較B組增多更加明顯(P＜0.01,圖3、4,圖3見彩圖頁(yè)Ⅳ)。

Fig.4 Apoptotic cell was detected by TUNEL in kidney of rats

2.3 波動(dòng)性高血糖對(duì)糖尿病大鼠腎臟JNK蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示,A組幾乎未見p-JNK蛋白表達(dá),B組和C組腎小管上皮細(xì)胞p-JNK蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng),且C組較B組表達(dá)更強(qiáng)(圖5見彩圖頁(yè)Ⅳ)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,B組和C組的JNK蛋白和p-JNK蛋白表達(dá)量均較A組明顯增高,且C組高于B組(圖6)。

Fig.6 p-JNK protein level was detected by Western blot in kidney of rats

3 討論

糖尿病患者的高血糖主要有兩種形式,包括慢性波動(dòng)性高血糖與慢性持續(xù)性高血糖。隨著糖尿病患者多項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)的開展以及對(duì)其病理生理機(jī)制的深入研究,目前多數(shù)研究認(rèn)為,糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展不僅與血糖整體水平升高有關(guān),也與血糖的波動(dòng)性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),相同的HbA1c值可以存在不同的血糖狀況,具有相近HbA1c值的患者中,血糖波動(dòng)較大者發(fā)生慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)更大[6]。本實(shí)驗(yàn)中,我們通過對(duì)糖尿病大鼠12周模型的研究,發(fā)現(xiàn)糖尿病血糖波動(dòng)組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)是持續(xù)高血糖組的1.55倍,凋亡尤其發(fā)生在腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞,因此進(jìn)一步證實(shí)在糖化血紅蛋白水平相似的糖尿病動(dòng)物中,血糖的波動(dòng)幅度增大可加重腎小管上皮細(xì)胞的凋亡程度,研究已表明,腎組織細(xì)胞凋亡是DN的發(fā)生發(fā)展中一個(gè)重要的早期事件。

慢性持續(xù)性高血糖癥會(huì)導(dǎo)致過高的糖化反應(yīng)和氧化應(yīng)激的形成,而最近發(fā)現(xiàn)糖尿病發(fā)生的急性血糖波動(dòng)是觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)額外因素[7]。業(yè)已證實(shí),氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)。本研究表明,糖尿病穩(wěn)定高血糖組和波動(dòng)性高血糖組的腎臟氧自由基清除劑SOD活性降低,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加,且波動(dòng)性高血糖組的上述改變更加明顯,說明糖尿病時(shí)波動(dòng)性高糖引發(fā)的腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)較穩(wěn)定性高血糖增強(qiáng)。Yaqoob等[8]的早期研究提示,糖尿病發(fā)生的氧化應(yīng)激對(duì)腎小管的損傷可能先于腎小球損害。我們進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn),波動(dòng)性高血糖大鼠的腎小管Nox4表達(dá)較穩(wěn)定高血糖組更加明顯,細(xì)胞凋亡數(shù)也相應(yīng)增加。Nox4是NADPH氧化酶的一種重要亞型,主要在成年腎組織表達(dá),糖尿病時(shí)活性氧族(ROS)增高的來源有很多,其中NADPH氧化酶被認(rèn)為是ROS產(chǎn)生的最重要機(jī)制,能夠?qū)⒎肿友跬ㄟ^單電子還原產(chǎn)生過氧化自由基,并以此為基礎(chǔ)形成一系列ROS產(chǎn)物。高血糖可激活細(xì)胞內(nèi)PKC信息轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而活化NOX,而NOX抑制劑可有效抑制糖尿病大鼠腎組織中ROS的產(chǎn)生,減少蛋白尿和改善腎組織病理改變,延緩DN的發(fā)生發(fā)展[9]。以上結(jié)果提示,與穩(wěn)定性高血糖比較,波動(dòng)性高血糖狀態(tài)下的腎小管上皮凋亡增加與氧化應(yīng)激水平增高有密切關(guān)系。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí),氧化應(yīng)激能導(dǎo)致JNK激活,JNK又是細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中的重要調(diào)控者。一般認(rèn)為,JNK被磷酸化激活后,能通過轉(zhuǎn)錄依賴或轉(zhuǎn)錄非依賴機(jī)制調(diào)控下游靶基因的表達(dá)或靶蛋白的活性而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn),JNK被活化后可從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)位入核,通過磷酸化激活c-Jun、c-Fos等轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)?；罨腏NK也可留在胞質(zhì)內(nèi),催化Bcl-2家族抗凋亡蛋白磷酸化而失去活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病持續(xù)高血糖組和波動(dòng)高血糖組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)JNK蛋白的磷酸化水平均明顯高于正常對(duì)照組,且波動(dòng)高血糖組較持續(xù)高血糖組變化更為明顯,這與其氧化應(yīng)激水平和凋亡程度增加的趨勢(shì)一致,提示血糖波動(dòng)可能作為一種刺激信號(hào),會(huì)引發(fā)較單純高血糖更加嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng),通過激活JNK,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

[1]王先令,陸菊明.血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病預(yù)后及其慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的影響[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè),2005,25(3):169-173.

[2]Kumar D,Zimpelmann J,Robertson S,et al.Tubular and interstitial cell apoptosis in the streptozotocin-diabetic rat kidney[J].Nephron Exp Nephrol,2004,96(3):e77-88.

[3]金可可,林艷紅,王萬鐵,等.血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2007,23(3):570-573.

[4]Piconi L,CorgnaliM,Da Ros R,et al.The protective effect of rosuvastatin in human umbilical endothelial cells exposed to constant or intermittent high glucose[J].J Diabetes Complications,2008,22(1):38-45.

[5]Nakano H,Nakajima A,Sakon-Komazawa S,et al.Reactive oxygen species mediate crosstalk between NF-κ B and JNK[J].Cell Death Differ,2006,13(5):730-737.

[6]Lachin J M,Genuth S,Nathan D M,et al.Effect of glycemic exposure on the risk of microvascular complications in the diabetes control and complications trial-revisited[J].Diabetes,2008,57(4):995-1001.

[7]Colette C,Monnier L.Acute glucose fluctuations and chronic sustained hyperglycemia as risk factors for cardiovascular diseases in patientswith type 2 diabetes[J].Horm Metab Res,2007,39(9):683-686.

[8]Yaqoob M,McClelland P,Patrick A W,et al.Evidence of oxidant injury and tubular damage in early diabetic nephropathy[J].QJM,1994,87(10):601-607.

[9]Nam S M,Lee M Y,Koh JH,et al.Effects of NADPH oxidase inhibitor on diabetic nephropathy in OLETF rats:the role of reducing oxidative stress in itsprotective property[J].DiabetesRes Clin Pract,2009,83(2):176-182.

[10]Weston C R,Davis R J.The JNK signal transduction pathway[J].Curr Opin Cell Biol,2007,19(2):142-149.