劉 嵐，傅 睿

（1.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部2007級(jí)；2.江西省兒童醫(yī)院a.消化科；b.腎內(nèi)科，南昌 330006）

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬于皰疹病毒科5型，為雙鏈線(xiàn)狀DNA病毒，是宮內(nèi)感染中最常見(jiàn)的病原。HCMV能侵害多種臟器如肝臟、肺、神經(jīng)系統(tǒng)等，其中肝臟是最易受累的臟器之一。肝臟內(nèi)多種細(xì)胞如肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞可被HCMV感染，導(dǎo)致肝細(xì)胞病變和壞死、肝細(xì)胞凋亡和膽管病變，可引起肝功能損害、膽汁淤積、肝臟腫大、肝纖維化和膽管狹窄或閉鎖[1]。嬰兒時(shí)期由于感染HCMV而引起以黃疸、肝臟腫大、肝功能損害為主要臨床表現(xiàn)的疾病稱(chēng)為嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎（infantile cytomegalovirus hepatitis），是我國(guó)嬰兒期人群中最常見(jiàn)的肝臟疾病之一。新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子白介素-17（IL-17）是一種前炎癥因子，具有強(qiáng)大的介導(dǎo)炎癥功能，且有研究發(fā)現(xiàn)IL-17在多種肝病的發(fā)病及抗病毒免疫中均有表達(dá)[2-3]。本文旨在初步探討肝組織中IL-17的表達(dá)與嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎發(fā)病及肝纖維化的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

病例組：選擇2009—2011年江西省兒童醫(yī)院23例行腹腔鏡下膽道沖洗術(shù)排外膽道閉鎖的嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎患兒的肝組織標(biāo)本。

對(duì)照組：選擇同期10例非肝臟疾病死亡嬰兒的尸檢肝組織標(biāo)本。

嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎患兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合中華醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分會(huì)感染消化學(xué)組在湖北宜昌會(huì)議修訂的《巨細(xì)胞病毒感染診療方案》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并除外其他病原引起的肝炎（甲、乙、丙肝炎病毒，EB病毒，風(fēng)疹病毒及弓形體等）。

1.2 試劑

兔抗人IL-17單克隆抗體（武漢博士德生物有限公司）；兩步法檢測(cè)試劑盒（PV-9000）、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

所有肝組織標(biāo)本都常規(guī)經(jīng)過(guò)4%甲醛固定、石蠟包埋后，切4 μm厚標(biāo)本片備用。MASSON染色確定纖維化分級(jí)，免疫組織化學(xué)二抗-酶標(biāo)多聚體二步法（SP法）進(jìn)行IL-17的免疫組織化學(xué)染色。染色結(jié)果判斷：顯微鏡下觀察，組織和細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒者視為IL-17染色陽(yáng)性。依據(jù)肝臟組織IL-17顯色范圍來(lái)記分:無(wú)陽(yáng)性染色，記0分；見(jiàn)陽(yáng)性染色組織，范圍占總標(biāo)本范圍的25%以下記“+”，算 1分；26%～50%記“”，算 2分；51%～75%記“”，算 3 分；75%以上記“”，算 4 分[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，分析方法包括2組獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)、雙等級(jí)變量的Kendall相關(guān)分析、1組等級(jí)變量與1組連續(xù)變量的雙變量Spearman相關(guān)分析。P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組肝組織中IL-17的表達(dá)情況

病例組肝組織中IL-17表達(dá)水平為1.348±0.487，秩均值為30.41；對(duì)照組肝組織中IL-17表達(dá)水平為0.300±0.483，秩均值為7.90。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，病例組IL-17水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.525，P＜0.01）。

2.2 病例組肝組織IL-17的表達(dá)與纖維化的關(guān)系

病例組的IL-17水平與纖維化程度呈正相關(guān)，Kendall相關(guān)系數(shù) r=0.734，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

近年來(lái)，在自身免疫病和過(guò)敏性疾病中發(fā)現(xiàn)一種不同于Th1型和Th2型的細(xì)胞亞群，此亞群細(xì)胞可產(chǎn)生IL-17、IL-6和TNF-α，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[5]，該型CD4+T細(xì)胞被稱(chēng)為T(mén)h17細(xì)胞。Th17細(xì)胞產(chǎn)生的最重要的效應(yīng)因子是IL-17。IL-17是一群可溶性細(xì)胞因子的統(tǒng)稱(chēng)，是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)早期啟動(dòng)因素[6]，近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)IL-17參與了多種肝臟炎癥疾病的發(fā)病。唐永明等[7]證實(shí)在各種慢性肝病的發(fā)病過(guò)程中血清IL-17水平均有明顯升高，且與患者肝纖維化程度及HA、LN、ⅣC水平相關(guān)。邢直直等[8]發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者血清中IL-17水平升高。楊江華等[9]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-17參與了丙型肝炎（HCV）的發(fā)病過(guò)程且與肝臟炎癥活動(dòng)、肝損害密切相關(guān)。但未見(jiàn)有IL-17與巨細(xì)胞病毒肝炎發(fā)病的臨床研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病例組肝組織中IL-17呈陽(yáng)性表達(dá)，且主要表達(dá)在肝竇區(qū)、匯管區(qū)及纖維化區(qū)；而對(duì)照組肝組織中IL-17無(wú)表達(dá)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)圍生期嬰兒肝臟被HCSV感染后，由于肝組織的炎性反應(yīng)，被激活的肝間質(zhì)細(xì)胞會(huì)大量表達(dá)TGF-β；樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的Toll樣受體可以和感染的病毒受體結(jié)合后DC可大量分泌促炎癥因子IL-6[10]。IL-6可與 TGF-β 共同促進(jìn) Th-17細(xì)胞的分化[11]，增多的Th-17細(xì)胞可以釋放更多的IL-17。IL-17能通過(guò)趨化因子IL-8、MCP-1和 Gro-α（growth-relatedprotein-α）介導(dǎo)中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞趨化到炎癥部位，能誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）[12]，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。 IL-17 可以刺激靶細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8[13]、一氧化氮合成酶-2（NOS-2）和前列腺素E2等增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。推測(cè)IL-17在嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎的發(fā)病過(guò)程中通過(guò)多種途徑促進(jìn)了肝臟持續(xù)的炎癥，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡、肝臟損傷。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎患兒，IL-17主要在肝竇區(qū)、匯管區(qū)及纖維化區(qū)、間質(zhì)呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性部位與纖維化關(guān)系密切?，F(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-17與肝纖維化密切相關(guān)。R.Y.Lan等[14]在膽汁性肝硬化患者肝組織中發(fā)現(xiàn)肝門(mén)部有大量Th-17細(xì)胞數(shù)量增多和IL-17+細(xì)胞增多。秦來(lái)英等[15]發(fā)現(xiàn)在HBV感染患者肝組織內(nèi)IL-17明顯增高，且隨肝纖維化程度的增高而表達(dá)增強(qiáng)。現(xiàn)證實(shí)某些細(xì)胞因子如 TGF-β、IL-6、IL-1、INF-α 等可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。體外研究發(fā)現(xiàn)IL-17與TGF-β、TNF-α、IL-6、IL-1等細(xì)胞因子之間存在著密切的生物學(xué)關(guān)系：TGF-β和IL-6可誘導(dǎo)Th17的生成，這一過(guò)程可以被IL-1和TNF-α增強(qiáng)，增多的Th17細(xì)胞可分泌更多的 IL-17[16-17]。 此外 2011年孟繁立等[18]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IL-17在小鼠肝纖維化過(guò)程中起到了重要的作用，除了可以直接激活肝星狀細(xì)胞（HSC）產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），也可以間接通過(guò)激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子激活HSC。推測(cè)IL-17可能參與了巨細(xì)胞病毒性肝炎肝纖維化的進(jìn)程，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎患兒的肝組織中IL-17表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組，并且其表達(dá)強(qiáng)度與肝纖維化程度有相關(guān)性。提示IL-17在嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎發(fā)病過(guò)程及纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

[1] Mack C L，Sokol R J.Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia[J].Pediatr Res，2005，57（5Pt2）：87R-94R.

[2] Vergani D，Mieli Vergani G.Aetiopathogenesis of autoimmunehepatitis[J].WorldJGastroenter，2008，14（21）：3306-3312.

[3] Lemmers A,Moreno C,Gustot T，et a1.The Interleukin-17 pathway is involved in human alcoholic liver disease[J].Hepatology，2009，49（2）：646-657.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)感染消化組.巨細(xì)胞病毒感染診斷方案[J].中華兒科雜志，1999：37（7）：441.

[5] Harrington L E，Mangan P R，Weaver C T.Expangding the effector CD4-cell repertoire：the Th17 lineage[J].Curr Opin Immunol，2006，18（3）：349-356.

[6] Chisholm D M,Mason D K.Labialsalivary gland biopsy in Sjogren’s disease[J].Clin Path，1968，21：656-660.

[7] 唐永明，粱立敏，余建華，等.檢測(cè)IL-17和IL-18水平在纖維增生性疾病中的意義[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4（2）：88-90.

[8] 邢直直，杜文軍，陳士俊.輔助性T淋巴細(xì)胞 l、2、17在慢性乙型肝炎病毒感染狀態(tài)中的變化[D].濟(jì)南:山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2008.

[9] 楊江華，侯為順，楊利才，等.聚乙二醇Q干擾素對(duì)慢性丙型肝炎患者血清IL-17/IL-10與TGF-13的影響及意義[J].臨床消化雜志，2010，22（3）：138-140.

[10] Kryczek I，Baneriee M，Cheng P，et a1.Phenotype，distribution,generation and functional andclinical relev-ance of Thl7 cells in the human tumor environments[J].Blood，2009，114（6）：1141-1149.

[11] Liu Guang Wei，Zhao Yong.Toll-like receptors and immune regulation:their direct and Indirect modulation on regulatory CD4+CD25+Tcells[J].Immunology，2007，122：149-156.

[12] Aggarwal S，Gurney A L.IL-17：prototype member of an emerging cytokine family[J].Leuoe Biol，2002，71（1）：1.

[13] 湯紹濤，阮慶蘭.膽道閉鎖與細(xì)胞因子[J].中華小兒外科雜志，2003，24（1）：85-87.

[14] Lan R Y，Salunqa T L，Tsunevama K，et a1．Hepatic IL-17 responses in human and murine primarybiliary cirrhosis[J]．J Autoimmun，2009，32（1）：43-51．

[15] 秦來(lái)英，陳士俊.慢性乙型肝炎病毒感染者肝內(nèi)IL-17的表達(dá)及意義[D].濟(jì)南：山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2008.

[16] Bettelli E，Carrier Y，Gao W，et al.Reciprocal developmentalpathwaysforthe generation ofpathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J].Nature，2006，441：235-238.

[17] Veldhoen M，Hocking R J，Atkins C J，et al.TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milien supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells[J].Immunity，2006，24：179-189.

[18] 孟繁立，王凱.Ⅰ型干擾素受體以及Th-17在慢性肝病中的變化及其意義[D].濟(jì)南：山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2011.