馬繼紅 王洪珊
(哈藥集團有限公司制藥總廠 黑龍江 哈爾濱 150086)
1.1 供試品:頭孢地尼(批號:201204012012040220120403)。
1.2 培養(yǎng)基及試液:營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂、營養(yǎng)肉湯、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、改良馬丁、四硫磺酸鈉、膽鹽硫乳瓊脂、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。
1.3 菌種:枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉。
1.4 儀器:電熱恒溫水浴鍋、電動離心機。
1.5 青霉素酶(600萬單位/支)張家口市格瑞生物化學(xué)科技有限公司。
2.1 菌液制備
2.1.1 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,30~35℃培養(yǎng)18~24小時,分別取各菌種培養(yǎng)液1mL加入9mL0.9%無菌氯化鈉中,10倍依次稀釋,金黃色葡萄球菌稀釋至10-5,大腸埃希菌稀釋至10-7,枯草芽孢桿菌稀釋至10-5,約為50~100cfu/mL,備用。
2.1.2 接種白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基,23~28℃培養(yǎng)24~48小時,取培養(yǎng)液1mL加入9mL0.9%無菌氯化鈉中,10倍依次稀釋至 10-6,約為 50~100cfu/mL,備用。
2.1.3 取黑曲霉新鮮培養(yǎng)物用5mL0.9%無菌氯化鈉適量與標(biāo)準(zhǔn)比濁管進(jìn)行比較,取比濁后的菌懸液1mL加入9mL0.9%無菌氯化鈉中,10倍依次稀釋至10-4,約為50~100cfu/mL,備用。
2.2 供試液制備
取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL,水?。?5℃)保溫振搖,分散混勻,制成1:10的供試液。
2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)驗證試驗
2.3.1 試驗組
1)取規(guī)定量供試液,置無菌條件離心(500轉(zhuǎn)/分)3分鐘,取上清液置無菌試管中,用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補至原量,混勻后取1mL加至100mLpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,加青霉素酶一支,混勻,按中國藥典2010版附錄微生物限度檢查法中薄膜過濾法進(jìn)行過濾,單膜沖洗量300mL,并在最后100mL沖洗液中加入相應(yīng)試驗菌液1mL,沖洗后取出濾膜,菌面朝上,貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上,置規(guī)定條件下培養(yǎng),每株試驗菌平行制備2個平皿。
2)霉菌、酵母菌計數(shù):采用中和法。取供試液1mL加至平皿中,加青霉素酶一支,試驗菌液1mL,注入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15~20mL,置規(guī)定條件下培養(yǎng),每株試驗菌平行制備2個平皿。
2.3.2 菌液組:取制備好的各菌液1mL,分別加入平皿中,分別加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15~20mL和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15~20mL,置規(guī)定條件培養(yǎng),測定所各試驗菌數(shù)。每株試驗菌制備2個平皿。
2.3.3 供試品對照組:取規(guī)定量供試品,方法同試驗組,加入相應(yīng)培養(yǎng)基,每株試驗菌平行制備2個平皿。
2.3.4 稀釋劑對照組:取稀釋劑1mL替代供試液,方法同試驗組,每株試驗菌平行制備2個平皿。
2.3.6 培養(yǎng):細(xì)菌計數(shù)平板30~35℃培養(yǎng)3天;霉菌、酵母菌計數(shù)平板23~28℃培養(yǎng)5天,逐日點計菌數(shù)。
2.3.7 判斷標(biāo)準(zhǔn):稀釋劑對照組及試驗組的菌回收率應(yīng)≥70%。三次試驗結(jié)果見表1、表2、表3。
表1 第一次試驗細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)驗證結(jié)果
表2 第二次試驗細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)驗證結(jié)果
2.4 控制菌檢查方法驗證
2.4.1 試驗組:取供試液10mL,置無菌條件離心(500轉(zhuǎn)/分)3分鐘,取上清液置無菌試管中,用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液補至原量,混勻后轉(zhuǎn)入100mLpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,加青霉素酶一支,混勻,按中國藥典附錄“微生物限度檢查法”中薄膜過濾法進(jìn)行過濾,沖洗量單膜300mL,在最后100mL沖洗液中加入相應(yīng)試驗菌液1mL,沖洗后取出濾膜,放至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,30~35℃培養(yǎng)18~24小時。取培養(yǎng)物0.2mL接種至5mLMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi),培養(yǎng),于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察,同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光,為MUG陽性;不呈現(xiàn)熒光,為MUG陰性。沿培養(yǎng)管的管壁加數(shù)滴靛基質(zhì)試液,液面呈玫瑰紅色,為靛基質(zhì)陽性;呈試劑本色,為靛基質(zhì)陰性。本底對照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。
表3 第三次細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)驗證結(jié)果
2.4.2 陰性對照組:方法同試驗組,加入1mL陰性菌(即金黃色葡萄球菌液,濃度同細(xì)菌數(shù)驗證)。
三次試驗結(jié)果列表表示相同,統(tǒng)一列表見表4。
2.5 結(jié)果判斷2.5.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證結(jié)論:在三次獨立平行試驗中,稀釋劑對照組菌的回收率均>70%,試驗組菌的回收率均>70%,可照此方法測定頭孢地尼的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。
表4 三次試驗控制菌驗證結(jié)果
2.5.2 控制菌驗證結(jié)論:在三次獨立平行試驗中,陰性對照組未檢出陰性對照菌,試驗組檢出陽性試驗菌,可照此法進(jìn)行頭孢地尼的控制菌檢查。
結(jié)果表明,頭孢地尼采用上述方法進(jìn)行微生物限度檢查,霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)測定采用中和法,細(xì)菌數(shù)測定采用低速離心(500轉(zhuǎn)/分)3分鐘、薄膜過濾(每膜沖洗300mL,并加入青霉素酶1支)的方法時,各試驗菌的回收率均>70%,控制菌檢查采用低速離心低速離心(500轉(zhuǎn)/分)3分鐘、薄膜過濾(單膜沖洗300mL,并加入青霉素酶1支)。根據(jù)中國藥典2010年版的相關(guān)規(guī)定,此法適用于頭孢地尼的微生物限度檢查。
[1]中國藥典[M].2010年版.