王貴華 汪 漢 孫梅芹 彭 柯 唐 兵 楊大春 楊永健 張 鑫 侯言彬 鄧玨琳

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心血管內科，四川 成都 610083)

Klotho基因與衰老和竇房結功能密切相關，三者之間可能存在一定關聯(lián)，但具體的分子生物學機制尚不明確〔1～4〕，闡明心臟Klotho基因表達有助于進一步研究其在竇房結的功能，為病態(tài)竇房結綜合征(病竇)開辟新的治療途徑。鑒于小鼠出生后心臟Klotho基因表達的增齡性變化尚未見報道，本研究擬采用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(RT-PCR)檢測不同日齡小鼠心臟Klotho基因表達的變化，探討昆明小鼠Klotho基因的表達及其在心臟的確切定位，研究Klotho基因與心臟生長發(fā)育和竇房結之間的關系。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 1、120 d和540 d昆明小鼠各15只，2、4、7、15、30、60、180、270 d 和 360 d 昆明小鼠各 10 只，雌雄各半，昆明小鼠購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物中心(批號:A09-C57BL-1021)。

1.2 PCR引物 登陸GenBank(Klotho ID:16591;Klotho mRNA:NM-013823.1)獲得C57BL小鼠Klotho基因序列，由Premer 5.0軟件設計特異性引物，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，用無RNA酶無菌雙蒸水配置成溶液，-20℃保存。

1.3 主要試劑及儀器 Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，立陶宛MBI公司;Taq DNA聚合酶，北京博大泰克公司;dNTP:美國Promega公司;DNA分子量標準:北京TIANGEN公司;瓊脂糖:法國BIOWEST公司;FTC2000實時熒光定量基因擴增儀:加拿大FUNGLYN公司;PE9600DNA擴增儀:美國PE公司;Gel Doc 1000:美國Bio-rad公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 昆明小鼠心臟組織總RNA的提取及鑒定 實驗組:取1、2、4、7、15、30、60、120、180、270、360 d 和 540 d 昆明小鼠各10只，斷頸處死，快速剪取整個心臟組織;取1、180、540 d昆明小鼠各5只，處死后快速取出心臟，切除右心房后，以余下的心臟組織作為陰性對照;并取出腎臟組織作為陽性對照。按Trizol RNA分離試劑說明書操作。進行總RNA完整性檢驗。

1.4.2 逆轉錄合成 cDNA Klotho引物序列:正義鏈:5'-GTACCTGGTTGCCCACAA-3';反義鏈:5'-CTTCGAGGATTGATCCAATG-3';探針序列:5'-CTCATGCCAAAGTCTGGCATCTC-3'，產物長度129 bp。GADPH引物系列:正義鏈:5'-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3'，反義鏈:5'-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3';探針序列:5'-FAM-ACCACAGTCCATGCCATCAC-TAMRA-3'，產物長度141 bp。依據以上引物及探針序列，在PCR儀上操作。

1.4.3 Klotho mRNA的實時熒光定量PCR檢測 依次進行實時熒光定量PCR的優(yōu)化;對待測基因Klotho和管家基因GADPH，選擇相應基因的cDNA模板進行PCR反應，確認PCR反應產物和測序;Klotho mRNA的實時熒光定量PCR檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數據以x±s表示。多組之間采用方差分析檢驗，組間兩兩比較采用LSD方法檢驗。

2 結果

2.1 昆明小鼠心臟組織總RNA純度與完整性鑒定 提取的總RNA樣品經1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察可見28、18、5 S三條亮度依此遞減的清晰條帶，泳道上無明顯彌散痕跡，其中28 S與18 S條帶亮度比值約為2∶1，無蛋白質和DNA污染。紫外分光光度計測定樣品的OD260/OD280結果在1.7～2.0之間，可用于cDNA的合成。

2.2 小鼠Klotho和GADPH擴增產物的凝膠電泳鑒定 常規(guī)PCR擴增產物電泳鑒定:Klotho(129 bp)和GAPDH(141 bp)擴增片段經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，顯示擴增得到大約130 bp左右的片段，清晰，無雜帶，與設計的產物理論大小很相近。

鑒于Klotho基因主要在腎臟表達，特選取腎臟組織作為陽性對照，以切除右心房后的心臟組織作為陰性對照，不加模板cDNA作為試劑空白對照。電泳結果表明，昆明小鼠腎臟組織有Klotho基因mRNA表達，完整心臟可檢測到Klotho基因表達，切除右心房的心臟組織未能擴增到相應產物;在小鼠腎臟組織和切除右心房的心臟組織，均可檢測到內參基因GAPDH;試劑對照組泳道上沒有明顯條帶，表明試劑沒有污染。見圖1。提示Klotho基因可能僅在右心房區(qū)域表達，在其他心房及心室不表達。

2.3 昆明小鼠心臟組織Klotho基因mRNA的表達 RT-PCR檢測結果顯示:1、2、4、7、15、30、60、120、180、270、360 和 540 d昆明小鼠心臟組織均可檢測到Klotho基因的表達，其表達量分別為:1.086±0.258;1.134±0.275;2.021±0.534;2.580±0.584;2.270±0.680;2.460±0.572;3.196±0.541;6.232±0.549;6.128±0.325;5.867±0.545;4.356±0.263;3.182±0.561。結果表明在540 d內的昆明小鼠心臟Klotho基因mRNA基本呈持續(xù)表達狀態(tài)。出生后第1天及第2天Klotho基因的表達量均較低，與4 d后的表達量有統(tǒng)計學意義(P=0.000);在4 d后，表達呈曲線波動，15 d時表達量降低，之后持續(xù)升高，直到120 d時，此時Klotho表達mRNA最高，與第60天(P=0.006)相比有統(tǒng)計學差異;180 d(P=0.081)、270 d(P=0.052)時的表達量與120 d時的表達量差異無統(tǒng)計學意義;540 d(P=0.000)、360 d(P=0.002)時的表達量與270 d時的表達量差異有統(tǒng)計學意義，表明270 d之后，Klotho基因在心臟組織的表達量呈下降趨勢。

圖1 小鼠Klotho和GADPH的表達

3 討論

國外的研究〔4〕觀測到Klotho基因在小鼠心臟的表達局限于右心房和上腔靜脈交界處的心外膜下細胞內，這一區(qū)域恰好對應于竇房結區(qū)域，免疫組化及Western印跡證實小鼠心臟其他部位可能并不存在Klotho基因的表達，野生型小鼠和Klotho雜合小鼠過度運動后，后者竇房結恢復時間明顯增長，讓兩種小鼠異種共生后，Klotho鼠的竇房結功能退化的癥狀也明顯好轉。最近亦有研究〔5〕認為Klotho基因通過影響其他組織細胞的Ca2+離子通道或其他細胞因子發(fā)揮其生物學作用。以上研究和我們的研究提示Klotho基因在維持竇房結功能中有重要作用，有可能是單獨的Klotho基因通過調節(jié)K+、Ca2+或者Na+通道對竇房結功能進行作用。

針對Klotho基因在竇房結的研究〔4〕則表明Klotho基因可能僅在竇房結周圍區(qū)域表達，且在應激狀態(tài)下的竇房結起搏功能或者是竇房結功能異常與Klotho基因膜型mRNA表達有關。有研究表明實時熒光定量PCR較印記雜交可以檢測到腎臟Klotho基因微量的表達，我們的研究運用熒光定量PCR，證實了在Klotho基因mRNA在右心房的表達在一定年齡范圍內隨增齡而增加，而超一定年齡范圍卻隨增齡而減弱，這也許可以解釋低于60歲的人群病竇的發(fā)病率極低的情況。

研究均認為竇房結的衰老自成年期開始，以后隨著年齡的增長以及心肌缺血變化而發(fā)生結細胞退行性變緩慢的進行性加重，膠原纖維脂肪組織增生，在這個過程中與竇房結離子通道相關的基因如起搏電流基因的產物超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道蛋白2、4均隨增齡而表達呈衰減的趨勢〔6〕;Xiao等〔7〕的研究發(fā)現，在10歲以前，人血清的分泌型Klotho蛋白水平較低，在30～40歲左右達到高峰，而后隨著年齡的增加反而下降。這些研究都間接提示Klotho基因的表達可能不是一直呈遞增或者遞減的狀態(tài)，與我們的研究結果相吻合。實際上Klotho基因敲除后的純合子突變小鼠在應激情況下會出現固定心率減慢，竇性停搏，竇房傳導阻滯，以及緩慢的交界性心律，直至完全性停搏。這些表現與病竇〔8〕極其相似，由此推測，Klotho基因突變小鼠可能能夠成為病竇的一種模型小鼠，而多數研究認為病竇在50～79歲(即近乎人類老年期左右)之間為發(fā)病高峰期，聯(lián)系到Klotho基因突變的小鼠，推測在小鼠的老年期，Klotho基因的表達可能是呈遞減趨勢的，而在老年期之前，Klotho基因的表達似乎是呈遞增趨勢漸至高峰，此前提及的研究〔7〕也證明了這一點。我們推測Klotho基因的峰型的表達可能會直接或者間接作用于起搏電流基因的產物超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道蛋白2、4致使其表達量出現相應的改變，從而引起起搏電流的改變，導致病竇的產生。

1 Wang Y，Sun Z.Current understanding of klotho〔J〕.Ageing Res Rev，2009;8(1):43-51.

2 袁 丹，陳海平.抗衰老Klotho基因的功能及與人類疾病的關系〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(14):2074-6.

3 Masuda H，Chikuda H，Suga T，et al.Regulation of multiple ageing-like phenotypes by inducible klotho gene expression in klotho mutant mice〔J〕.Mech Ageing Dev，2005;126(12):1274-83.

4 Takeshita K，Fujimori T，Kurotaki Y，et al.Sinoatrial node dysfunction and early unexpected death of mice with a defect of klotho gene expression〔J〕.Circulation，2004;109(14):1776-82.

5 Sopjani M，Alesutan I，D?rmaku-Sopjani M，et al.Regulation of the Na(+)/K(+)ATPase by klotho〔J〕.FEBSLett，2011;585(12):1759-64.

6 Yanni J，Tellez J，Sutyagin P，et al.Structural remodelling of the sinoatrial node in obese old rats〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2010;48(4):653-62.

7 Xiao N，Zhang Y，Zheng Q，et al.Klotho is a serum factor related to human aging〔J〕.Chin Med J，2004;117(5):742-7.

8 Monfredi O，Dobrzynski H，Mondal T，et al.The anatomy and physiology of the sinoatrial node——a contemporary review〔J〕.Pacing Clin Electrophysiol，2010;33(11):1392-406.