吳之浩

（義烏市中心醫(yī)院 普外一科， 浙江 金華 322000）

低氧是實體瘤局部微環(huán)境的特征之一。低氧時，腫瘤細胞發(fā)生惡性生物學行為改變：糖酵解途徑、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強，對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，對放化療不敏感等[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧應激促進人HepG-2細胞黏附、侵襲和遷移[2]。本研究模擬肝癌低氧微環(huán)境，探討低氧應激對人HepG-2細胞甲胎蛋白（AFP）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-1、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9表達的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株和主要試劑 人肝癌細胞株HepG-2引自蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實驗科（來源于美國國立腫瘤研究所）， 胎牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品，RT-PCR Kit 購于Takara公司，Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品。MMP-9、TIMP-1、VEGF ELISA試劑盒、AFP放射免疫試劑盒由上海生物制品研究所提供。

1.2 體外細胞培養(yǎng)及實驗分組 HepG-2細胞置滅活10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5天傳代一次。低氧組HepG-2細胞置37 ℃、5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表達量的測定 Trizol一步法提取細胞總RNA，電泳見28 s、18 s條帶，以2.5μg總RNA為模板，以Takara公司的Random premier為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA。根據(jù)Genebank中人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin mRNA序列，用primer premier5.0計算機軟件設計引物（引物由Invitrogen公司合成，引物序列見表1）。優(yōu)化PCR反應條件，分別進行AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9與β-actin共擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像儀攝片，用IamgeMaster Total v1.01軟件半定量分析各條帶面積，計算各目的基因與內(nèi)參照β-ac-tin的光密度比值表示各目的基因的mRNA表達量。

表1 人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin引物設計

1.4 HepG-2細胞培養(yǎng)上清AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9含量的測定 取處于對數(shù)生長期的HepG-2細胞，按每孔1×105個細胞接種于24孔培養(yǎng)板，常氧、低氧組HepG-2細胞于常氧、低氧培養(yǎng)24 h；吸取細胞培養(yǎng)上清經(jīng)1000 r/min離心15 min，取上清；放射免疫測定法測定AFP，酶聯(lián)免疫吸附法測定VEGF、TIMP-1、MMP-9含量，均嚴格按試劑盒說明操作。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達 常氧、低氧組總RNA的28 s和18 s條帶比值為2:1，表明所提取的總RNA完整性好，可用于RT-PCR實驗。圖1和表2顯示：低氧組AFP、VEGF、MMP-9蛋白及mRNA的表達顯著高于常氧組，TIMP-1蛋白及mRNA的表達顯著低于常氧組（均P＜0.01）。

圖1 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表達

表2 各組人HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達（n=8±s）

表2 各組人HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達（n=8±s）

與常氧組比：aP＜0.01

)常氧組 0.33±0.06144.68±7.30 0.42±0.0526.17±3.38 0.58±0.06 51.45±6.83 0.30±0.0466.24±4.20低氧組 0.57±0.05a187.93±5.60a0.59±0.06a52.70±4.03a0.29±0.04a30.44±7.12a 0.50±0.05a89.76±4.62a

2.2 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的相關性 VEGF mRNA與AFP、MMP-9 mRNA呈正相關（r=0.820、0.878，P＜0.01），與TIMP-1 mRNA呈負相關（r=-0.880，P＜0.01）；AFP mRNA與MMP-9 mRNA呈正相關（r=0.830，P＜0.01），與TIMP-1 mRNA呈負相關（r=-0.722，P＜0.01）；MMP-9 mRNA與TIMP-1 mRNA呈負相關（r=-0.835，P＜0.01）；VEGF蛋白與AFP、MMP-9蛋白呈正相關（r=0.923、0.876，P＜0.01），與TIMP-1蛋白負相關（r=-0.771，P＜0.01），AFP蛋白與MMP-9蛋白呈正相關（r=0.917，P＜0.01），與TIMP-1蛋白負相關（r=-0.848，P＜0.01），MMP-9蛋白與TIMP-1蛋白負相關（r=-0.863，P＜0.01）。

3 討論

低氧是實體瘤局部微環(huán)境的特征之一。低氧時低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α基因表達上調(diào)，轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)與HIF-1β形成異二聚體HIF-1。HIF-1與靶基因的啟動子或增強子上的低氧反應元件（hypoxia response element，HRE）5’-ACGTGC-3’結(jié)合，上調(diào)靶基因的表達并介導一系列腫瘤細胞對低氧的反應，腫瘤細胞發(fā)生惡性生物學行為改變：糖酵解途徑、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強，對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，對放化療不敏感等[1]。VEGF[3]、MMP-9[4]是HIF-1的靶基因，啟動子上存在HIF-1結(jié)合位點HRE。VEGF基因表達上調(diào)促進腫瘤血管新生[3]，同時也是一種免疫調(diào)節(jié)因子，能夠削弱樹突狀細胞功能而降低宿主的抗腫瘤免疫反應[3]。MMP-9（明膠酶B）屬于高度保守的Zn2+依賴的內(nèi)切蛋白水解酶家族，可降解明膠和IV、V、VII、X型基底膜膠原和細胞外基質(zhì)，TIMP-1能選擇性結(jié)合MMP-9活性中心的Zn2+，封閉其催化活性，從而特異性地抑制MMP-9的活性[5]。通常情況下，組織中MMP-9和TIMP-1之間保持著相對平衡狀態(tài)，它們的平衡和相互影響決定著細胞基質(zhì)是降解還是聚集和腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[6]。本實驗顯示：低氧應激上調(diào)HepG-2細胞VEGF基因的表達，與文獻[1]研究結(jié)果一致；上調(diào)MMP-9基因的表達，與文獻[4]研究結(jié)果一致；下調(diào)TIMP-1基因的表達。低氧應激上調(diào)HepG-2細胞MMP-9基因的表達、下調(diào)TIMP-1基因的表達，可能是低氧下肝癌細胞侵襲力增強的機制之一。

AFP基因?qū)儆诎椎鞍谆蚣易澹腥齻€增強子，是原發(fā)性肝細胞癌診斷的重要血清標記物，參與細胞增殖和代謝的調(diào)節(jié)，能促進肝癌細胞增殖[7]。本實驗顯示：低氧應激上調(diào)HepG-2細胞AFP基因的表達。賀濤等[8]研究提示：沉默AFP基因可抑制肝癌細胞的增殖活性。低氧應激上調(diào)HepG-2細胞AFP基因的表達可能是低氧下肝癌細胞增殖活性增強的機制之一。

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