尉曉娜，謝于鵬，夏譽(yù)，何金彩

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 睡眠中心，浙江 溫州 325000）

低氧是特殊的單因素溫和暴露刺激，目前關(guān)于低氧對腦損害的研究主要體現(xiàn)在認(rèn)知功能方面，大量研究發(fā)現(xiàn)不同的低氧可以引起青年鼠空間參考記憶的損害[1-3]。但低氧對小鼠曠場實(shí)驗(yàn)行為影響的研究甚少。有報道稱，在曠場活動中，急性低氧可以引起新生鼠水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動增加[4-5]，但是長期低氧尤其是不同種類的長期低氧對小鼠曠場活動的影響報道少見。本實(shí)驗(yàn)對不同時間低氧對成年小鼠曠場實(shí)驗(yàn)行為、體質(zhì)量的影響進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料設(shè)備 6月齡雄性C57BL/6J小鼠34只（購自上海斯來克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司），體質(zhì)量23～28 g，清潔級動物，按國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃之間，濕度45%～55%。常壓低氧動物飼養(yǎng)艙購自長沙華曦電子科技有限公司，壓縮高純度氮?dú)猓舛龋?9.99%）（溫州市申鹿氣體有限公司），曠場實(shí)驗(yàn)及視頻分析軟件（北京碩林苑科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案 按每天低氧時間不同隨機(jī)分成4組：低氧1組（8 h/d，n=9），低氧2組（12 h/d，n=8），低氧3組（24 h/d，n=9），正常氧濃度對照組（n=8）。低氧組小鼠在低氧艙中飼養(yǎng)8周后，檢測所有小鼠曠場實(shí)驗(yàn)的行為變化并檢測其體質(zhì)量、心重指數(shù)變化。

1.3 模型的建立 所有低氧組小鼠暴露在常壓低氧動物飼養(yǎng)艙內(nèi)以普通飼料、普通飲水飼養(yǎng)。氧艙內(nèi)條件：吸入O2濃度為8%～10%，CO2濃度低于1%，溫度為（22±2）℃，濕度為45%～55%。動物自由攝食攝水，每周7 d，連續(xù)8周。每隔3～4 d花10 min左右清洗籠子。對照組小鼠在正常氧濃度條件下飼養(yǎng)，CO2濃度、溫度、濕度、飲用水、飼料與低氧組小鼠相同。

1.4 曠場實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6]。曠場實(shí)驗(yàn)箱是長×寬×高為50 cm×50 cm×40 cm的黑色箱，底部畫有虛擬的16個小正方格，分成沿側(cè)壁的外周格（12個小方格），其余的中央格（4個小正方格），正上空有錄像檢測系統(tǒng)并與計算機(jī)分析軟件系統(tǒng)相連。實(shí)驗(yàn)開始時，操作者輕輕將小鼠放在正中央?yún)^(qū)，系統(tǒng)開始同步自動記錄小鼠5 min穿越每個格子的時間、路程。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用毛巾蘸取低濃度酒精擦拭箱底，等待其揮發(fā)消散避免留有氣味影響其他小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 心重指數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱每只小鼠的體質(zhì)量，處死小鼠，分離心臟，算出每只小鼠的心重指數(shù)（心臟質(zhì)量/體質(zhì)量）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件包進(jìn)行分析。多個樣本間計量資料的比較采用單因素方差分析法，兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 小鼠穿越格子次數(shù)：見表1。與對照組比較，低氧1組小鼠總格數(shù)、中央格、外周格穿越次數(shù)均明顯增加，與對照組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），低氧2組小鼠外周格、總格也明顯增加與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），低氧3組增加不明顯。低氧1、2、3組增加幅度依次變小。

2.1.2 小鼠跨越不同區(qū)域的路程：見表2。與對照組比較，低氧1組小鼠總路程、中央路程、外周路程明顯增多，與對照組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），低氧2組小鼠外周路程、總路程也明顯增多，與對照組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），低氧3組增加不明顯。低氧1、2、3組增加幅度依次變小。

表1 各組小鼠穿越格子次數(shù)比較（次±s）

表1 各組小鼠穿越格子次數(shù)比較（次±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與低氧3組比：cP<0.05

低氧1低氧2低氧3對照9898 26.56±9.15bc 16.63±1.72 10.11±2.55 4.15±0.99 80.22±19.30bc 60.38±3.47b 39.89±7.88 16.88±4.77 106.78±28.41bc 77.00±4.69a 50.00±10.37 21.00±5.72

表2 各組小鼠跨越不同區(qū)域的路程比較（m±s）

表2 各組小鼠跨越不同區(qū)域的路程比較（m±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與低氧3組比：cP<0.05

組別低氧1低氧2低氧3對照n9898中央1.45±0.52bc 0.96±0.16 0.51±0.17 0.14±0.08外周7.06±1.65bc 5.41±0.24a 3.66±0.63 1.60±0.41總路程8.51±2.16bc 6.37±0.28a 4.17±0.78 1.75±0.47

2.1.3 小鼠曠場實(shí)驗(yàn)中各區(qū)域停留時間：見表3。低氧暴露后，各低氧組小鼠主要停留在外周區(qū)，低氧組與對照組比較在中央?yún)^(qū)、外周區(qū)停留時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表3 各組小鼠曠場實(shí)驗(yàn)中各區(qū)域停留時間比較（s±s）

表3 各組小鼠曠場實(shí)驗(yàn)中各區(qū)域停留時間比較（s±s）

組別低氧1低氧2低氧3對照n9898中央18229.78±3490.45 27027.63±9332.59 13885.00±5688.21 6015.88±2999.26外周274555.22±3526.31 267327.75±9300.20 280274.78±5567.06 289886.75±2977.39

2.2 低氧暴露對小鼠體質(zhì)量及心臟的影響 見表4。與對照組比較，各低氧組小鼠體質(zhì)量均減輕，低氧3組小鼠體質(zhì)量減輕最明顯且與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與對照組比較，低氧1、2、3組小鼠心重指數(shù)依次增大。

表4 低氧前后各組小鼠體質(zhì)量及心重指數(shù)變化（±s）

表4 低氧前后各組小鼠體質(zhì)量及心重指數(shù)變化（±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與低氧3組比：cP<0.01

組別低氧1低氧2低氧3對照n9898低氧前體質(zhì)量(g)24.56±0.50 24.38±0.63 24.78±0.68 25.63±0.68低氧8周體質(zhì)量(g)24.33±0.44bc 24.50±0.38ac 19.44±0.53bc 26.38±0.71c心重指數(shù)(×10-3)4.54±0.13c 4.64±0.13c 5.60±0.24b 4.28±0.16bc

3 討論

低氧后小鼠體質(zhì)量明顯下降，心重指數(shù)明顯增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；每日低氧時間越長小鼠體質(zhì)量下降越明顯，心臟損害越嚴(yán)重，這說明低氧模型建立成功。

低氧是種溫和刺激，與重復(fù)電刺激、強(qiáng)迫游泳[7]等不同，避免了因刺激本身產(chǎn)生的疼痛厭惡情緒對小鼠曠場實(shí)驗(yàn)行為的影響。曠場實(shí)驗(yàn)可用于測試動物的活動量、活躍程度、探索行為及對新空曠環(huán)境的認(rèn)知能力，還可測評焦慮情緒。小鼠對開闊的新環(huán)境具有躲避傾向，這與小鼠先天喜歡在周邊區(qū)活動的習(xí)性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用曠場實(shí)驗(yàn)檢測低氧后成年小鼠曠場實(shí)驗(yàn)活動變化。低氧后小鼠的外周格穿越次數(shù)、中央格穿越次數(shù)、總格穿越次數(shù)及相應(yīng)的路程均增加，說明低氧可以引起小鼠活動量的異常增加，這與以前研究結(jié)果[4，8]一致。小鼠活動與腦結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)[8]，低氧后小鼠活動增加可能與低氧引起運(yùn)動皮層結(jié)構(gòu)改變有關(guān)系[4]。另外小鼠在曠場內(nèi)的行為受活動能力和情緒改變（動機(jī)、焦慮和應(yīng)激）兩方面的影響[9-10]，很難確定到底是哪個因素引起的活動能力改變，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。所有實(shí)驗(yàn)小鼠的外周區(qū)停留時間明顯長于中央?yún)^(qū)停留時間，這與小鼠先天對空曠環(huán)境產(chǎn)生恐懼，喜歡沿壁活動的習(xí)性有關(guān)，并且說明低氧并不能改變小鼠的活動習(xí)性。與對照組相比，低氧后小鼠中央?yún)^(qū)停留時間并無顯著延長，說明低氧對小鼠新環(huán)境認(rèn)知能力影響不是很明顯。

總之，低氧可以引起小鼠曠場實(shí)驗(yàn)中活動的增加及體質(zhì)量下降，隨著每日低氧時間的延長，小鼠自發(fā)活動異常增加的幅度反而下降，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 葉小軍,陳松芳,王小同,等.川芎嗪對慢性低O2高CO2大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,37(2):145-146.

[2] Dusek JA, Eichenbaum H. The hippocampus and memory for orderly stimulus relations[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(13):7109-7114.

[3] Mayes A, Montaldi D, Migo E. Associative memory and the medial temporal lobes[J].Trends Cogn Sci,2007,11(3):126-135.

[4] Levshina IP, Mats VN, Pasikova NV, et al. Comparison of the behavior of rats after immobilization with structural changes in the motor cortex[J]. Neurosci Behav Physiol,2009,39(9):915-919.

[5] Iuvone L, Geloso MC, Dell’Anna E , et al. Changes in open field behavior, spatial memory, and hippocampal parvalbumin immunoreactivity following enrichment in rats exposed to neonatal anoxia[J].Exp Neurol,1996,139(1):25-33.

[6] 范新六,李峰,宋月晗,等.四慧合劑對睡眠剝奪大鼠曠場及高架十字迷宮行為的影響[J].天津中醫(yī)藥,2011,28(2):142-144.

[7] 李歡歡,林文娟,李俊發(fā).強(qiáng)迫性冷水游泳應(yīng)激對大鼠行為和海馬神經(jīng)顆粒素的影響[J].心理學(xué),2005,37(3):366-372.

[8] Ten VS,Wu EX,Tang H, et al. Late measures of brain injury after neonatal hypoxia-ischemia in mice[J].Stroke,2004,35(9):2183-2188.

[9] Ireland Z,Dickinson H,Fleiss B, et al. Behavioural effects of near-term acute fetal hypoxia in a small precocial animal,the spiny mouse (Acomys cahirinus)[J]. Neonatology,2010,97(1):45-51.

[10] Karl T, Pabst R, von Horsten S. Behavioral phenotyping of mice inpharmacological and toxicological research[J]. Exp Toxicol Pathol,2003,55(1):69-83.