丁維軍，梁曉東，于長(zhǎng)輝，朱敏

（臺(tái)州醫(yī)院 放療科，浙江 臺(tái)州 317000）

水通道蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一組與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，影響水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境平衡調(diào)節(jié)，在腦組織中主要為水通道蛋白4（AQP4），參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中腦水腫的形成[1]。急性期腦放射損傷表現(xiàn)為頭痛、昏睡、嘔吐等癥狀，一般認(rèn)為其與腦水腫和血腦屏障破壞有關(guān)[2]。筆者在成功建立放射性腦損傷模型基礎(chǔ)上，觀察早期放射性腦損傷大鼠海馬區(qū)AQP4 mRNA表達(dá)的變化，探討AQP4在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 雌性SD大鼠分組與全腦照射 健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，平均（200±10）g，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK浙2008-0033）。隨機(jī)分為20 Gy單次全腦照射后1 d、1周、2周、4周和8周及對(duì)照6個(gè)組別，每組各6只。X線照射方法[3]：大鼠經(jīng)3.6%水合氯醛麻醉（1 mL/100 g腹腔注射）后，俯臥于西門子加速器床板（西門子KD2型），應(yīng)用加速器產(chǎn)生的6MV-X線（劑量率200～210 cGy/min），源皮距SSD 100 cm，單次全腦照射，照射野3 cm×2 cm，光野上界位于雙眼后眥連線，下界位于雙耳后連線，左右露空。用1 cm厚的組織補(bǔ)償物覆蓋照射野。鉛塊屏蔽雙眼、頸部、胸腹部，參考深度為1.5 cm，照射總劑量20 Gy。

1.2 標(biāo)本制作及海馬區(qū)AQP4 mRNA測(cè)定 大鼠全腦照射后1 d、1周、2周、4周和8周，大鼠3.6%水合氯醛麻醉（1 mL/100 g腹腔注射）后開胸，0.9%氯化鈉溶液250 mL灌注后，取海馬區(qū)腦組織液氮速凍研磨成粉后，Trizol抽提總RNA。RT-PCR檢測(cè)AQP4 mRNA的表達(dá)：提取的總RNA，加入隨機(jī)引物及M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA鏈。取cDNA 0.1μg，加入10×Buffer 2.5μL，25 mmol/L MgCl21μL，10 mmol/L dNTP0.5μL，20 pmol/μL的上下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，滅菌雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)足至25μL。Thermo PX2型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參照。AQP4反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 2 min；94 ℃變性45 s，61 ℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。引物序列：AQP4引物:上游引物5’-TCCTCTACCTGGTCACACCC-3’，下游引物5’-GTCTTCTGTCTCCACTTGGCT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)458 bp。最后延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.7%瓊脂糖凝膠電泳，于BIO-RAD Gel 2000凝膠成像儀上成像，Quantity One軟件作半定量分析。

1.3 腦含水量測(cè)定 于各時(shí)間點(diǎn)在各組大鼠海馬區(qū)取厚度大約相同的腦組織，放在電子天平稱重，然后用鋁箔包裹放入恒溫電烤箱中100 ℃烘烤＞24 h，電子天平稱腦組織干重，按Elliot公式計(jì)算腦組織含水量[4]。腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬區(qū)腦組織AQP4 mRNA的表達(dá) 圖1示各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)AQP4 mRNA的表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，大鼠20 Gy全腦照射后1 d下降，照射后1周達(dá)最低點(diǎn)（P＜0.01），2周時(shí)仍低于對(duì)照（P＜0.01），4周時(shí)高于對(duì)照組（P＜0.01），8周時(shí)仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠海馬區(qū)腦含水量的比較 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)含水量，與對(duì)照組比較，大鼠20 Gy全腦照射后1 d無明顯變化，照射后1周增加（P＜0.05），2周明顯增加（P＜0.01），4周時(shí)達(dá)高峰（P＜0.01），8周時(shí)仍明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），具體見表1。

圖1 大鼠海馬區(qū)腦組織AQP4 mRNA的表達(dá)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)腦含水量（n=6±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)腦含水量（n=6±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別 AQP4 mRNA 腦含水量（%）對(duì)照組 4.69±0.32 77.62±1.41 1d 4.24±0.39 78.99±1.34 1周 3.04±0.50b 79.64±0.90a 2周 3.71±0.32b 81.24±0.67b 4周 5.55±0.33b 83.96±0.81b 8周 5.45±0.27a 82.48±0.68b

2.3 各組大鼠腦含水量與AQP4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦含水量與AQP4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.435，P＜0.01）。

3 討論

水通道蛋白是一組對(duì)水有高度選擇性的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。腦組織中的水通道蛋白主要是AQP4，主要分布于毛細(xì)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦室室管膜細(xì)胞，海馬、視上核、室旁核和下丘腦等核團(tuán)內(nèi)也有分布，促進(jìn)細(xì)胞間、血管與腦室間水分子運(yùn)動(dòng)。有研究結(jié)果表明，AQP4的誘導(dǎo)表達(dá)與血腦屏障的破壞有關(guān)[5]。AQP4在缺血性腦卒中、全腦缺血后腦水腫中具有重要作用[6]。創(chuàng)傷性皮層損傷腦出血模型大鼠AQP4 mRNA在損傷位點(diǎn)的表達(dá)明顯增高，且同期MRI檢查顯示AQP4表達(dá)水平與水腫程度明顯相關(guān)[7]。而在敲除AQP4的轉(zhuǎn)基因小鼠腦缺血卒中模型中，則具有減輕腦水腫作用[8]。而在低O2高CO2小鼠腦損傷模型早期，小鼠腦組織AQP4表達(dá)明顯增高，腦細(xì)胞水腫[9]AQP4在腦水腫病理機(jī)制中的確切作用尚不明確，可能參與腦水腫的形成和消退。在6個(gè)月高血壓大鼠模型的額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬星形細(xì)胞足突AQP4表達(dá)上調(diào)，可能促使血腦屏障破壞，導(dǎo)致腦損傷[10]。缺血后早期AQP4可能通過移除組織中水分而限制腦水腫形成，而并不能阻止血腦屏障的破壞[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠20 Gy單次全腦照射后1 d、1周海馬區(qū)AQP4 mRNA表達(dá)下調(diào)，2周、4周和8周海馬區(qū)AQP4 mRNA上調(diào)，而此時(shí)海馬區(qū)表現(xiàn)為腦水腫。放射性腦損傷早期，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量下降，血腦屏障破壞，水和大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞外間隙。腦照射后1個(gè)月，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血腦屏障通透性逐漸恢復(fù)。腦照射1個(gè)月后，血腦屏障再次破壞，導(dǎo)致腦組織乏氧和反應(yīng)性氧化物釋放。AQP4具有跨細(xì)胞膜雙向水流通調(diào)節(jié)功能，既可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)水?dāng)z入，也可促進(jìn)細(xì)胞外液水清除[12]。AQP4具有促進(jìn)血管性腦水腫細(xì)胞外間隙內(nèi)水腫液清除的作用，提示大鼠腦照射后AQP4水平增強(qiáng)，可能是一種保護(hù)性反應(yīng)，以減輕腦水腫的形成。陳應(yīng)柱等[13]報(bào)道全腦照射后早期大鼠腦皮質(zhì)AQP4的蛋白表達(dá)下降，認(rèn)為AQP4在腦水腫形成過程中表達(dá)增強(qiáng)或降低的時(shí)間取決于血腦屏障破壞的早晚。而本研究認(rèn)為，放射性腦損傷時(shí)AQP4變化與血腦屏障間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。通過建立AQP4基因敲除大鼠放射性腦損傷模型，深入研究AQP4在放射性腦損傷發(fā)生發(fā)展中的病理生理作用，以便為放射性腦損傷提供新的治療策略。

[1] Lo AC,Chen AY,Hung VK,et al. Endothelin-1 overexpression leads to further water accumulation and brain edema after middle cerebral artery occlusion via aquaporin 4 expression in astrocytic end-feet[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2005,25(8):998-1011.

[2] Wong CS, Van der Kogel AJ. Mechanisms of radiation injury to the central nervous system: implications for neuroprotection[J]. Mol Interv,2004,4(5):273-284.

[3] 丁維軍,俞秋興,田野. 大鼠全腦照射后腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子含量的變化[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004, 34(3):173-175.

[4] 田野,包仕堯,殷蔚伯. 大鼠半腦照射后早期腦內(nèi)血流量和含水量變化的研究[J]. 中華放射腫瘤學(xué)雜志,1999,8(1):43-46.

[5] Papadopoulos MC, Verkman AS. Aquaporin-4 and brain edema[J]. Pediatr Nephrol,2007,22(6):778-784.

[6] Aoki K,Uchihara T,Tsuchiya K, et al. Enhanced expression of aquaporin 4 in human brain with infarction[J]. Acta Neuropathol,2003,106(2):121-124.

[7] Griesdale DE, Honey CR. Aquaporins and brain edema[J].Surg Neurol,2004,61(5):418-421.

[8] Manley GT, Fujimura M, Ma T, et al. Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke[J]. Nat Med,2000,6(2):159-163.

[9] 房春燕,代允義,宋興偉,等. 低O2高CO2對(duì)小鼠血腦屏障及水通道蛋白-4表達(dá)的影響[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,39(2):104-107.

[10] Tomassoni D,Bramanti V,Amenta F. Expression of aquaporins 1 and 4 in the brain of spontaneously hypertensive rats[J]. Brain Res,2010,1325:155-163.

[11] Hirt L,Ternon B,Price M,et al. Protective role of early aquaporin 4 induction against postischemic edema formation[J].J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(2):423-433.

[12] Saadoun S, Papadopoulos MC. Aquaporin-4 in brain and spinal cord oedema[J]. Neuroscince,2010,168(4):1036-1046.

[13] 陳應(yīng)柱,鮑歡,田野,等. 大鼠全腦照射后早期大腦皮質(zhì)水通道蛋白4表達(dá)變化的研究[J]. 中華放射腫瘤學(xué)雜志,2007,16(2):140-142.