路偉振 吳蓓麗 趙 強(qiáng)③

①碩士，②③研究員，中國科學(xué)院上海藥物研究所，中國科學(xué)院受體結(jié)構(gòu)與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203

G蛋白偶聯(lián)受體：七次跨膜結(jié)構(gòu)的超級分子
——2012年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)簡介

路偉振①吳蓓麗②趙 強(qiáng)③

①碩士，②③研究員，中國科學(xué)院上海藥物研究所，中國科學(xué)院受體結(jié)構(gòu)與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203

G蛋白偶聯(lián)受體 腎上腺素受體 七次跨膜結(jié)構(gòu)

G蛋白偶聯(lián)受體是人類基因組中最大也是最重要的一類蛋白質(zhì)，它們幾乎參與了生物體中所有的生命活動。這一類受體的發(fā)現(xiàn)、功能研究以及結(jié)構(gòu)解析為我們了解生理調(diào)控以及疾病的發(fā)生與治療等帶來新的曙光。在此之前，G蛋白偶聯(lián)受體的相關(guān)研究已經(jīng)被九次授予諾貝爾獎(jiǎng)，而2012年，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)再次授予Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka，以表彰他們在此領(lǐng)域，尤其是腎上腺素受體上的相關(guān)研究。文中簡介了G蛋白偶聯(lián)受體的研究歷程，其獨(dú)特的七次跨膜結(jié)構(gòu)與激活機(jī)制，并對此領(lǐng)域的未來發(fā)展做了展望。

G 蛋 白 偶 聯(lián) 受 體 （G-protein coupled receptor，GPCR）也稱為七次跨膜受體，是一類膜受體超家族，目前約有800多個(gè)成員，人類基因組中有超過2%的基因用來編碼G蛋白偶聯(lián)受體。G蛋白偶聯(lián)受體是細(xì)胞表面參與信號傳導(dǎo)的分子中數(shù)目最龐大的家族，它們可以感應(yīng)無數(shù)種不同的細(xì)胞外信號，并進(jìn)一步誘發(fā)相應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)。正是由于感光、感應(yīng)化學(xué)分子的G蛋白偶聯(lián)受體的存在，才形成了我們的視覺、嗅覺和味覺等一系列的感知；而感應(yīng)荷爾蒙的G蛋白偶聯(lián)受體更是參與了機(jī)體內(nèi)很多重要的生理過程，例如神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、腺體中激素和酶的釋放、免疫反應(yīng)、心肌和平滑肌的收縮以及血壓的調(diào)控等等。由于這些受體功能的多樣性與重要性，幾乎所有的人類疾病中都可以發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體的影子，這些受體功能的紊亂與調(diào)控的異常會導(dǎo)致相應(yīng)疾病的發(fā)生，因此這一受體超家族一直被視為最好的藥物靶點(diǎn)。事實(shí)上，已經(jīng)證實(shí)現(xiàn)今藥物制劑作用的靶點(diǎn)中超過50%都是G蛋白偶聯(lián)受體［1］。

迄今為止，β2腎上腺素受體（β2AR）的相關(guān)研究就已經(jīng)兩次獲得諾貝爾獎(jiǎng)。在1988年，James Black就由于在腎上腺素受體阻斷劑心得安（propranolol）方面的研究獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，而2012年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予美國的兩名科學(xué)家Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka，以表彰他們在G蛋白偶聯(lián)受體研究中作出的突出貢獻(xiàn)，特別是對β2腎上腺素受體進(jìn)行了高分辨率的結(jié)構(gòu)解析和深入的功能研究，為揭示G蛋白偶聯(lián)受體的作用機(jī)制邁出了非常重要的一步。作為G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)研究所獲得的第10次諾貝爾獎(jiǎng)，這一殊榮不僅將G蛋白偶聯(lián)受體的研究帶到了一個(gè)新的高度，也必然引起新一輪的G蛋白偶聯(lián)受體研究熱潮。

1 G蛋白偶聯(lián)受體的發(fā)現(xiàn)與研究歷程

G蛋白偶聯(lián)受體的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有很長的歷史，可以追溯到19世紀(jì)中期。1870年研究人員發(fā)現(xiàn)了光敏感的視紫質(zhì)（rhodopsin），在此基礎(chǔ)上，George Wald在1933年又發(fā)現(xiàn)了視紫紅質(zhì)，其后的幾十年間圍繞視紫紅質(zhì)開展了大量的工作，對其作用機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，并成為G蛋白偶聯(lián)受體研究的最重要的研究模型系統(tǒng)之一。但是在當(dāng)時(shí)，并沒有人把感光系統(tǒng)與體內(nèi)激素的生理作用聯(lián)系起來。雖然受體理論在此之前就已經(jīng)創(chuàng)立，并在隨后得到迅速的發(fā)展，但是關(guān)于受體本身是什么物質(zhì)仍然是充滿了疑問與爭論，甚至有人質(zhì)疑受體是否真的存在。

1968年，Robert J.Lefkowitz開始利用放射性同位素追蹤細(xì)胞表面受體，β2腎上腺素受體的發(fā)現(xiàn)就得益于這種方法。首先他通過放射性同位素標(biāo)記，證明細(xì)胞表面存在特異識別腎上腺素的物質(zhì)，接著他與他的研究小組發(fā)現(xiàn)利用去污劑可以增加這種特異性物質(zhì)的可溶性，并使用腎上腺素將其受體從細(xì)胞膜中抽離了出 來。 隨 后，Brian K.Kobilka 加 入 了 Robert J.Lefkowitz的研究團(tuán)隊(duì)，開創(chuàng)性地將β2腎上腺素受體的編碼基因從倉鼠基因組中分離出來。通過序列比對，發(fā)現(xiàn)β2腎上腺素受體與牛視紫質(zhì)蛋白（rhodopsin）的氨基酸序列具有顯著的相似性，兩者都具有七次跨膜的區(qū)域。據(jù)此，Lefkowitz和Kobilka推斷rhodopsin和β2腎上腺素受體可能屬于同一家族，而這一家族可能編碼很多重要的激素受體。基于這一推論，Lefkowitz實(shí)驗(yàn)室的Kobilka等很快成功克隆了編碼人類β2腎上腺素受體、人類血小板α2腎上腺素受體、5-羥色胺（5HTA1A）受體等在內(nèi)的一系列受體的基因。他們的這些工作都極大地推動了G蛋白偶聯(lián)受體研究的發(fā)展。2007年，Brian K.Kobilka和他的研究團(tuán)隊(duì)解析出了人的β2腎上腺素受體的晶體結(jié)構(gòu)，這一突破性的研究成果拉開了人類G蛋白偶聯(lián)受體晶體結(jié)構(gòu)解析的序幕?？v觀β2腎上腺素受體的研究歷程，我們可以想象出這項(xiàng)工作的艱巨，花費(fèi)如此長的時(shí)間才得到其三級結(jié)構(gòu)也就不足為奇了。

2 G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)研究

通過結(jié)構(gòu)預(yù)測，研究人員很早就得知G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)為一個(gè)由7個(gè)α螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)，此外一小部分受體還包含胞外的N端或胞內(nèi)的C端結(jié)構(gòu)域，與此同時(shí)，早期的一些結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究得到的較低分辨率的結(jié)構(gòu)也給出了這7個(gè)α跨膜螺旋的大致走向。但是這些粗略的結(jié)構(gòu)無法解釋為何同樣是七次跨膜結(jié)構(gòu)，數(shù)百個(gè)不同的G蛋白偶聯(lián)受體家族卻能特異地識別小到光子，大到蛋白這些無論在體積還是在形狀、性質(zhì)上均有很大差別的底物分子，以及底物分子結(jié)合后，受體又是如何將信號進(jìn)一步傳遞給不同的細(xì)胞內(nèi)信號通路的。G蛋白偶聯(lián)受體的三維結(jié)構(gòu)解析工作歷來被認(rèn)為是最有挑戰(zhàn)性的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究之一，早期研究人員在此方向上花費(fèi)了無數(shù)的心血卻進(jìn)展甚微。研究人員第一次了解G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)來自于對視紫紅質(zhì)二維結(jié)構(gòu)的檢測，雖然當(dāng)時(shí)得到的結(jié)構(gòu)分辨率比較低，卻第一次觀察到G蛋白偶聯(lián)受體跨膜區(qū)域的構(gòu)象，成為其他G蛋白偶聯(lián)受體研究的分子模型［2－4］。2000年，Science雜志的封面文章介紹了視紫紅質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果，從而揭開了G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)的神秘面紗，成為G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域中的一個(gè)重要里程碑，奠定了其他G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)［5］。視紫紅質(zhì)作為G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)研究的模型也有其天然的優(yōu)勢：一方面人們可以從牛視網(wǎng)膜中獲得大量高純度的視紫紅質(zhì)，另外一方面則因?yàn)橐曌霞t質(zhì)非常穩(wěn)定，在其他G蛋白偶聯(lián)受體變性的環(huán)境中仍然能保持活性狀態(tài)［2，6］。2005年，Wayne A.等獲得了FSHR（follicle-stimulating hormone receptor）N端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與配體結(jié)合的復(fù)合體，其晶體結(jié)構(gòu)研究成果在Nature上發(fā)表，為結(jié)合糖蛋白類激素的受體的結(jié)構(gòu)研究開辟了先河；然而，美中不足的是解析出來的結(jié)構(gòu)缺少跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)域［7］。之后的兩年中，沒有其他的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)被解析出來，對G蛋白偶聯(lián)受體的研究也一直停留在利用定點(diǎn)突變和半胱氨酸掃描突變的方法檢測受體和配體的相互作用［8］。

G蛋白偶聯(lián)受體的三維結(jié)構(gòu)研究停滯的局面一直持續(xù)到2007年才得以打破。在這一年，Brian Kobilka和Raymond Stevens研究組共同解析了β2腎上腺素受體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。在此工作中，兩個(gè)研究組分別做出了開創(chuàng)性的貢獻(xiàn)：Brian Kobilka首次運(yùn)用在受體中插入可溶性蛋白片段的方法，這一可溶蛋白片段能顯著提高受體的穩(wěn)定性，并且有效地輔助晶體形成；Raymond Stevens則將脂立方相（lipidic cubic phase）這一結(jié)晶學(xué)新概念引入G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)研究中，并進(jìn)一步發(fā)展出如FRAP，LCP-Tm等一系列脂立方相工具用于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。隨著融合蛋白和脂立方相概念的推廣，G蛋白偶聯(lián)受體的三維結(jié)構(gòu)解析不再是一個(gè)個(gè)單獨(dú)的個(gè)案，開始變得有跡可循。至今研究人員共解析了14個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體的三維結(jié)構(gòu)，其中有12個(gè)受體的結(jié)構(gòu)解析采用了融合蛋白和脂立方相的方法，這些結(jié)構(gòu)也基本上都是由這兩家實(shí)驗(yàn)室完成或者參與完成的。

在解析了β2腎上腺素受體的結(jié)構(gòu)之后，Brian Kobilka和Raymond Stevens研究組的研究方向開始有了不同的側(cè)重。其中，Raymond Stevens研究組更側(cè)重于新的受體結(jié)構(gòu)解析。他們又陸續(xù)解析了A2A腺苷受體，CXCR4趨化因子受體以及D3多巴胺受體等7個(gè)受體的三維結(jié)構(gòu)。這些新解析出的結(jié)構(gòu)表明，雖然同樣是七次跨膜，但是小分子受體、磷脂分子受體、小分子和多肽受體等在跨膜螺旋的走向以及胞外環(huán)的結(jié)構(gòu)上都有許多不同的結(jié)構(gòu)特征，而這些結(jié)構(gòu)特征又與其生理功能息息相關(guān)。在這些結(jié)果的幫助下，研究人員已經(jīng)初步掌握一些G蛋白偶聯(lián)受體與其配體識別并相互作用的規(guī)律，并可據(jù)此對未知受體的相關(guān)信息進(jìn)行預(yù)測。當(dāng)然Raymond Stevens研究組的結(jié)果也表明，這一預(yù)測僅僅局限于一小部分我們了解得比較清楚的受體中，而針對大部分受體的預(yù)測仍然與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相差甚遠(yuǎn)［9］。

與 Raymond Stevens研究組不同，Brian Kobilka研究組在解析了β2腎上腺素受體的結(jié)構(gòu)之后更偏重于信號傳導(dǎo)的研究。他們?nèi)匀灰驭?腎上腺素受體為模型，進(jìn)一步解析了其與拮抗劑、激動劑以及G蛋白這一重要下游信號分子等各種復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果幫助研究人員進(jìn)一步認(rèn)識不同類型底物如何被受體識別，誘發(fā)受體發(fā)生構(gòu)象變化并進(jìn)一步將胞外的信號傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。其中，β2腎上腺素受體與G蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)是G蛋白偶聯(lián)受體研究中的里程碑式成果，它清楚地向研究人員展示了兩者之間是如何相互作用的，G蛋白又是如何被受體激活的，從而為后續(xù)的各項(xiàng)研究打下堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

3 G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)

在Brian Kobilka和Raymond Stevens等人的努力下，我們現(xiàn)在已經(jīng)比較清楚地了解了G蛋白偶聯(lián)受體的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。除了七次跨膜螺旋，受體分子還包含三個(gè)胞內(nèi)環(huán)以及三個(gè)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)。在三個(gè)胞內(nèi)環(huán)中，一般前兩個(gè)胞內(nèi)環(huán)較短，沒有特定的生理功能；第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)則變化較大，在不同的受體中長度可能從幾個(gè)氨基酸到一百余個(gè)氨基酸殘基不等。三個(gè)胞內(nèi)環(huán)中，通常第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)的功能最為重要，涉及G蛋白偶聯(lián)受體與G蛋白的識別及相互作用；但同時(shí)也由于其柔性太大，通常會被可溶蛋白片段取代或者缺乏均一的構(gòu)象，所以到目前為止具體的結(jié)構(gòu)仍不清楚。與此類似的，三個(gè)胞外環(huán)中，同樣第一個(gè)以及第三個(gè)胞外環(huán)較短，沒有明確的生物學(xué)功能；而第二個(gè)胞外環(huán)在不同的受體中差異比較大，有可能形成α螺旋，也有可能是β折疊，還有一部分受體的環(huán)區(qū)較短，僅形成簡單的無規(guī)則環(huán)區(qū)。第二個(gè)胞外環(huán)通常會形成一個(gè)類似蓋子的結(jié)構(gòu)罩住底物結(jié)合位點(diǎn)，不但有可能對底物的進(jìn)出造成影響，其部分殘基也參與了與底物的結(jié)合，它與螺旋一起形成了特異的選擇機(jī)制。

受體的跨膜螺旋形成兩個(gè)片層：螺旋I-IV形成一個(gè)片層，螺旋V-VII形成另外一個(gè)片層，兩個(gè)片層共同形成七次跨膜螺旋桶結(jié)構(gòu)（圖1A）。在7個(gè)螺旋中，通常有螺旋II，III，VI，VII形成底物結(jié)合口袋，負(fù)責(zé)特異地識別底物分子；而螺旋V則會與底物分子形成一定的接觸，并根據(jù)不同的底物形成相應(yīng)的構(gòu)象，進(jìn)一步調(diào)節(jié)受體的不同活性。構(gòu)成受體的7個(gè)螺旋并不完全是筆直的α螺旋，其中的大部分，尤其是V，VI，VII三個(gè)螺旋在中部都存在不利于螺旋結(jié)構(gòu)形成的脯氨酸，從而稍稍打斷形成彎折的螺旋結(jié)構(gòu)（圖1B）。正是由于這些彎折傾斜的存在，使得由于底物結(jié)合而引發(fā)的胞外區(qū)螺旋的微小擾動被放大，造成細(xì)胞內(nèi)螺旋的巨大構(gòu)象變化，從而激發(fā)下游信號分子。

得益于Brian Kobilka以及Raymond Stevens等人的出色工作，我們現(xiàn)在已經(jīng)能夠比較清楚地了解G蛋白偶聯(lián)受體在激活前后的構(gòu)象變化（圖2A）。在底物分子與受體結(jié)合后，受體螺旋的胞外區(qū)并沒有太大的變化，僅僅部分螺旋發(fā)生2?左右的微小位移，但是在胞內(nèi)區(qū)卻誘發(fā)了巨大的結(jié)構(gòu)改變。其中，螺旋片層I-IV的位置保持相對固定，而螺旋V發(fā)生輕微的旋轉(zhuǎn)并導(dǎo)致螺旋長度向胞內(nèi)區(qū)繼續(xù)延伸至少兩個(gè)螺旋，同時(shí)螺旋VI則向外延展超過14?。這兩個(gè)螺旋的變化導(dǎo)致受體胞內(nèi)區(qū)的螺旋桶形成巨大的空間，使得G蛋白的一部分可以結(jié)合在此空隙中；而與螺旋V，VI的外展不同，螺旋VII稍微內(nèi)收，并與G蛋白發(fā)生一定的相互作用，共同識別并行使信號傳導(dǎo)功能（圖2B，圖2C）。

圖1 G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)模型，分別從A）底物結(jié)合口袋方向以及B）脂雙層方向觀測。蛋白的七次跨膜按照從螺旋I-螺旋VII的順序顏色依次從藍(lán)色到紅色漸變

圖2 G蛋白偶聯(lián)受體的激活。A）G蛋白偶聯(lián)受體與G蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。其中，淺褐色部分代表G蛋白偶聯(lián)受體，綠色代表G蛋白α亞基，天藍(lán)色代表G蛋白β亞基，紫色代表G蛋白γ亞基。B）G蛋白偶聯(lián)受體處于活性與非活性狀態(tài)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)比較。其中綠色和藍(lán)色分別代表活性狀態(tài)下以及非活性狀態(tài)下的受體結(jié)構(gòu)［10］。C）G蛋白偶聯(lián)受體處于活性與非活性狀態(tài)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)比較示意圖［11］。箭頭代表相應(yīng)的區(qū)域在受體激活后發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化

4 β2腎上腺素受體研究進(jìn)展

近40年來，β2腎上腺素受體都作為G蛋白偶聯(lián)受體家族研究的模型，它是第一個(gè)通過放射性配體結(jié)合進(jìn)行研究的G蛋白偶聯(lián)受體，也是第一個(gè)用結(jié)晶學(xué)方法進(jìn)行 結(jié)構(gòu)研究的 神 經(jīng) 遞 質(zhì) 受 體［6，10，12－13］。 盡 管 越 來 越 多 的證據(jù)表明，GPCR存在二聚體，并且這些二聚體可能與一些GPCR的活化有關(guān)［2］，然而β2腎上腺素受體的活化不需要發(fā)生二聚化，其在晶體結(jié)構(gòu)中以單體形式存在，而且純化的β2腎上腺素受體也以單體形式存在，單體的β2腎上腺素受體整合到重組的高密度脂蛋白顆粒，從而與Gs蛋白偶聯(lián)［14］。激動劑與β2腎上腺素受體結(jié)合后促進(jìn)了其與GDP結(jié)合的αβr異源三聚體的相互作用，導(dǎo)致GDP和GTP的交換，Gs分離為Gα-GTP和Gβr亞基，分離后的兩個(gè)亞基可以調(diào)控不同細(xì)胞效應(yīng)因子的活性，Gαs固有的 GTP酶活性將 GTP水解為GDP，而Gα-GDP和Gβr重新結(jié)合后終止了信號的傳導(dǎo)（圖3）。β2腎上腺素受體被腎上腺素激活后，在心血管疾病以及肺功能方面有著重要的作用，人們已經(jīng)通過定點(diǎn)突變的方法鑒定出β2腎上腺素受體與配體相互作用的位點(diǎn)［10］。

在β2腎上腺素受體中存在著一定的結(jié)構(gòu)疏松區(qū)域，蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)和分子內(nèi)熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明疏松的結(jié)構(gòu)主要位于β2腎上腺素受體的C末端和第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)，這些區(qū)域在蛋白-蛋白之間的相互作用過程中有著重要的作用。對于水溶性蛋白來說，去除這些結(jié)構(gòu)疏松區(qū)有利于晶體的形成，而對于β2腎上腺素受體來說，這樣的做法會減少它的親水表面進(jìn)而導(dǎo)致晶格間的相互聯(lián)系。β2腎上腺素受體中C端結(jié)構(gòu)域的第二和第三個(gè)胞質(zhì)環(huán)參與了與G蛋白的相互作用，通過N端結(jié)構(gòu)域和第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)的C端促進(jìn)G蛋白的活化，C端結(jié)構(gòu)域則與G蛋白偶聯(lián)受體激酶、抑制劑和其他的一些信號分子相互作用［15－17］。

圖3 β2AR-Gs蛋白復(fù)合物中G蛋白循環(huán)示意圖［12］

為了進(jìn)一步對β2腎上腺素受體的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，理解G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，Brian K.Kobilka嘗試獲得β2腎上腺素受體-Gs蛋白復(fù)合體。然而這樣的工作面臨一個(gè)很大的問題，就是在去垢劑存在的條件下如何得到穩(wěn)定的β2AR-Gs復(fù)合體。雖然β2AR-Gs在磷脂雙分子層中可以有效地發(fā)生偶聯(lián)，但是在加入去垢劑后其偶聯(lián)效率急劇下降。后來Brian K.Kobilka發(fā)現(xiàn)在十二烷基麥芽糖苷溶液中，純化的GDPGs和過量的與高親和力配體結(jié)合的β2腎上腺素受體可以形成復(fù)合體［17］，然后加入三磷酸腺苷雙磷酸酶將GDP從Gs-GDP復(fù)合體上水解下來，就能夠得到穩(wěn)定的β2AR-Gs復(fù)合體。在這個(gè)過程中，將GDP從復(fù)合體上水解下來是非常有必要的，因?yàn)镚DP或者GTP的存在都會破壞β2腎上腺素受體和Gs的相互作用。2011年Brian K.Kobilka終于順利解析出了β2AR-Gs蛋白復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，研究成果發(fā)表在Nature上。他發(fā)現(xiàn)在這個(gè)復(fù)合體中，Gs與GTP的親和力遠(yuǎn)高于其與GDP的親和力，并且當(dāng)β2腎上腺素受體與Gs結(jié)合后與配體的親和力比β2腎上腺素受體單獨(dú)存在時(shí)高出了近100倍。β2AR-Gs復(fù)合體結(jié)構(gòu)的解析是人們第一次通過一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體來研究橫跨質(zhì)膜的信號傳導(dǎo)機(jī)制，為激動劑-β2AR-Gs三聚體的功能分析提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［10］。同年，Brian K.Kobilka又實(shí)現(xiàn)了另一突破，他利用抗體片段代替G蛋白，成功得到了抗體片段-激動劑-活化的β2腎上腺素受體三者的復(fù)合體，捕捉到在向細(xì)胞發(fā)送信號時(shí)的β2腎上腺素受體圖像。與之前只能解析出非活化狀態(tài)的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)相比，他的這一工作使G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)和功能的研究又上了一個(gè)新的臺階［18］。

與Brian K.Kobilka在β2腎上腺素受體結(jié)構(gòu)解析方面作出的貢獻(xiàn)相比，Robert J.Lefkowitz則對β2腎上腺素受體的功能及其介導(dǎo)的信號通路做了深入的研究，尤其對β-抑制蛋白在信號通路中的作用機(jī)制及功能做了全面解析。2011年，Robert J.Lefkowitz闡述了慢性應(yīng)激反應(yīng)和DNA損傷之間的關(guān)系，其研究成果在Nature上發(fā)表。流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)慢性應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致DNA損傷，應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)了DNA損傷后會加快人體老化，引發(fā)腫瘤形成以及一些精神疾病的發(fā)生，但是人們對DNA損傷的機(jī)制還不清楚。在這篇文章里Robert J.Lefkowitz就對其分子機(jī)制做了詳細(xì)的闡述，兒茶酚胺類配體與β2腎上腺素受體結(jié)合后，活化了β2腎上腺素受體，通過Gs-PKA和β-抑制蛋白信號通路，分別造成DNA的損傷和P53水平的下降，協(xié)同導(dǎo)致了DNA損傷的積累。在這篇文章中Robert J.Lefkowitz還解釋了β抑制蛋白新的功能，即在細(xì)胞核中作為E3連接酶的連接子，促進(jìn)E3連接酶與P53的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致了P53的泛素化程度增加，最后發(fā)生降解［19］。他的這一發(fā)現(xiàn)再次引起轟動，為腫瘤以及神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)疾病的診斷提供了理論依據(jù)。同年，Robert J.Lefkowitz和他的研究團(tuán)隊(duì)利用質(zhì)譜定量分析的策略，用同位素和琥珀酰苷分別標(biāo)記半胱氨酸的巰基和賴氨酸的氨基，檢測標(biāo)記的氨基酸的特定反應(yīng)來研究β2腎上腺素受體與不同的配體結(jié)合時(shí)動態(tài)的構(gòu)象變化。這種方法提供了各自側(cè)鏈特定的反應(yīng)信息，鑒定了β2腎上腺素受體與不同配體結(jié)合時(shí)的構(gòu)象變化［20］。Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka在GPCR領(lǐng)域所取得的成就令人折服，他們創(chuàng)造性的研究方法也為今后GPCR的研究工作開辟了蹊徑。

5 G蛋白偶聯(lián)受體研究現(xiàn)狀及問題

G蛋白偶聯(lián)受體的7個(gè)跨膜疏水區(qū)有很高的保守性，而N端、C端和跨膜結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)保守性相對比較低。不同種類的配體在G蛋白偶聯(lián)受體上的結(jié)合位點(diǎn)也不相同，小分子配體主要結(jié)合在G蛋白偶聯(lián)受體7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)圍成的疏水區(qū)，肽段和蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域則位于N端結(jié)構(gòu)域和胞外的親水環(huán)［21－22］。根據(jù)序列同源性和功能相似性進(jìn)行區(qū)分，G蛋白偶聯(lián)受體一共可以分為六大類，每一大類又可以分為很多不同的亞類，其中數(shù)目最多的視紫紅質(zhì)樣受體可以分為19個(gè)亞類。配體也可以根據(jù)其與受體結(jié)合后產(chǎn)生不同的效應(yīng)分為幾類：第一類是完全激動劑，與受體結(jié)合后可以最大程度地激活受體；第二類是部分激動劑，在飽和濃度下也不能完全激活受體；第三類是中立的拮抗劑，與受體結(jié)合后不產(chǎn)生明顯的信號傳導(dǎo)效應(yīng)，但是卻可以阻止其他的配體與受體結(jié)合；還有一類就是拮抗劑，與受體結(jié)合后會降低受體的本底活性。受體的活性因所結(jié)合配體種類的不同會增加或者下降，這樣看來，G蛋白偶聯(lián)受體就更像是一個(gè)分子變阻器而不是一個(gè)簡單的分子活性開關(guān)，與配體結(jié)合后既可以表現(xiàn)出最大的活性，也可以表現(xiàn)出不同程度的部分活性。找出不同G蛋白偶聯(lián)受體亞類作用機(jī)制和功能的不同是一項(xiàng)非常有意義的工作，尤其是對于那些高度保守的成員，區(qū)分不同的受體類型后就可以采用相應(yīng)的藥物進(jìn)行治療。通?？梢圆扇煞N方法區(qū)分不同的G蛋白偶聯(lián)受體亞類：第一種就是鑒定出受體的類型及其調(diào)控的生理過程，另一種就是找出可以選擇性地與相應(yīng)的一個(gè)或者一類受體結(jié)合的配體。但是，傳統(tǒng)的藥物療法通常不能區(qū)分同源性比較高的G蛋白偶聯(lián)受體，所以，盡管利用選擇性配體對G蛋白偶聯(lián)受體功能的研究非常重要，卻很難找到選擇性很高的配體［21］。

研究表明G蛋白偶聯(lián)受體存在多種、配體特異性的構(gòu)象狀態(tài)。Brian K.Kobilka曾經(jīng)用能量圖的方式直觀地描述蛋白受體構(gòu)象動態(tài)變化的過程，他把沒有結(jié)合配體時(shí)的受體狀態(tài)定義為最低能量狀態(tài)，不同的構(gòu)象之間存在著能量差異，即低能量構(gòu)象狀態(tài)向高能量構(gòu)象狀態(tài)轉(zhuǎn)化時(shí)，需要克服一定的能壘，能量變化的寬度則反映出受體構(gòu)象變化的靈活性。對于一個(gè)受體來說，配體結(jié)合的能量可以作為非活化狀態(tài)到活化狀態(tài)所需的能量，也可以用來減少或增加了兩種狀態(tài)間的能量差值，或者兩種情況都存在［22］。

與視紫紅質(zhì)不同，很多G蛋白偶聯(lián)受體表現(xiàn)出不依賴配體結(jié)合的本底活性，例如β2腎上腺素受體因其開放的結(jié)構(gòu)使得它在結(jié)合抑制劑的情況下仍保留了一部分的本底活性。受體的本底活性與結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定有關(guān)，分子內(nèi)的相互作用使受體維持在非活化狀態(tài)，G蛋白偶聯(lián)受體第三個(gè)跨膜區(qū)存在一段保守序列E／DRY，它們可以和第六個(gè)跨膜區(qū)上的谷氨酸殘基形成離子鎖，這也是配體活化的G蛋白偶聯(lián)受體和視紫紅質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的一個(gè)主要差別。在A類G蛋白偶聯(lián)受體家族中，這些氨基酸殘基通過極性相互作用形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，像一座橋梁一樣連接著兩個(gè)跨膜螺旋，穩(wěn)定了非活化狀態(tài)的構(gòu)象。對于β2腎上腺素受體來說，這些位點(diǎn)的突變可以增加β2腎上腺素受體的本底活性，并且研究表明，完全激動劑和部分激動劑與受體結(jié)合后都可以改變離子鎖附近的結(jié)構(gòu)，破壞分子內(nèi)的相互作用。對于那些缺少完整的離子鎖的晶體來說，可能有兩種原因造成這種情況：第一種是因?yàn)檫@種相互作用不存在于結(jié)合配體的受體中，另外一種就是這種相互作用非常弱以致在晶體生長的過程中消失［23］。

受體活化可能主要通過兩種機(jī)制：首先是配體的結(jié)合打破G蛋白偶聯(lián)受體胞質(zhì)內(nèi)固有的相互作用，即破壞離子鎖附近的結(jié)構(gòu)；其次是產(chǎn)生新的相互作用，包括配體上化學(xué)取代基和G蛋白偶聯(lián)受體上特定氨基酸殘基之間的相互作用等等，這是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。配體就像一座橋，介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體跨膜結(jié)構(gòu)域之間的聯(lián)系，進(jìn)而形成一個(gè)更加有活性的構(gòu)象狀態(tài)，并且影響跨膜結(jié)構(gòu)域的空間排布［22］。

G蛋白偶聯(lián)受體是一種多能的信號分子，這可能源于它們靈活多變的三維空間結(jié)構(gòu)。先前采用生物傳感器和體外熒光標(biāo)記的方法研究七次跨膜蛋白存在的不同的構(gòu)象，盡管這些研究可以觀察到激動劑誘導(dǎo)的受體構(gòu)象的變化，但是并不十分準(zhǔn)確，而且缺乏系統(tǒng)性。同時(shí)，盡管X射線衍射已解析出多種七次跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，可以提供靜態(tài)原子水平的結(jié)構(gòu)信息，但是仍然存在一定的局限性。為了獲得這些動態(tài)分子高分辨率的晶體衍射數(shù)據(jù)，我們會采取一定措施減少這些受體結(jié)構(gòu)的靈活性，例如用T4L取代高度可變的ICL3以及與抗體共結(jié)晶以穩(wěn)定受體構(gòu)象，所以這些結(jié)構(gòu)并不能展示未經(jīng)修飾的七次跨膜區(qū)復(fù)雜的動態(tài)過程。尋找能夠檢測跨膜區(qū)動態(tài)變化過程的方法對于研究其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用和活化的機(jī)制就顯得尤為重要，更好地理解這些動態(tài)特征對基于結(jié)構(gòu)的藥物研發(fā)來說有著重要的意義［20］。然而，這種動態(tài)的變化也給結(jié)構(gòu)分析帶來了巨大的挑戰(zhàn)。晶體的形成需要穩(wěn)定的、構(gòu)象均一的蛋白，人們很難獲得沒有結(jié)合配體的天然的G蛋白偶聯(lián)受體晶體；即便獲得了這樣的晶體，也可能只是得到了晶體眾多天然構(gòu)象中的一種。盡管目前的NMR技術(shù)還很難獲得高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，但是NMR是研究這些蛋白動態(tài)過程的最有可能的方法［23］。

6 G蛋白偶聯(lián)受體研究展望

隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，現(xiàn)在解析出一種G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)所需要的時(shí)間也越來越短，到目前為止，已經(jīng)有十幾種G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)被解析出來。G蛋白偶聯(lián)受體研究工作快速推進(jìn)的同時(shí)，也對人們提出了更高的要求，不僅僅局限于單純地獲得其晶體結(jié)構(gòu)，G蛋白偶聯(lián)受體的活化機(jī)制以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，也都成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。G蛋白偶聯(lián)受體活化時(shí)都發(fā)生了哪些構(gòu)象變化，配體是通過什么機(jī)制誘導(dǎo)了受體構(gòu)象的變化等等一系列的問題都亟待解決。晶體結(jié)構(gòu)信息對G蛋白偶聯(lián)受體藥物的研發(fā)有很大的幫助，雖然越來越多的G蛋白偶聯(lián)受體晶體結(jié)構(gòu)被解析出來，但是這些模型對藥物研發(fā)者來說仍然顯得不夠精確。分子?？繉?shí)驗(yàn)表明，非活化狀態(tài)的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)只有在鑒定那些穩(wěn)定非活化狀態(tài)結(jié)構(gòu)的配體時(shí)結(jié)果才可信［23］；因此除了對G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行結(jié)晶外，還需要發(fā)展一些新的方法去獲得受體和激動劑結(jié)合時(shí)的結(jié)構(gòu)。只有G蛋白偶聯(lián)受體與激動劑結(jié)合才能提供受體活化狀態(tài)的三維構(gòu)象，這些結(jié)構(gòu)將有助于闡明構(gòu)象變化與配體結(jié)合之間的關(guān)系，G蛋白偶聯(lián)受體靶向的藥物療法既包括激動劑也包括反激動劑，所以這些結(jié)構(gòu)將會對藥物化學(xué)和藥理學(xué)的研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

（2012年11月20日收到）

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G Protein Coupled Receptors，the Magic Molecules with Seven Transmembrane Helices：A Brief Introduction to the Nobel Prize in Chemistry 2012

LU Wei-zhen①，WU Bei-li②，ZHAO Qiang③
① ② ③Professor，CASKeyLaboratoryofReceptorResearch，ShanghaiInstituteofMateriaMedica，ChineseAcademyofSciences，Shanghai201203，China

G protein coupled receptors are the largest and the most important protein family in human genome，which involved in almost all of the living activities.The gene cloning，functional studies and structural determination of these receptors shed a new light on understanding the physiological regulation and the pathogenicity and treatment of almost all the human diseases.The Nobel Prize had issued to related research for 9 times，and in 2012，the Nobel Prize in Chemistry was issued to two American scientists，Robert J.Lefkowitz and Brian K.Kobilka，for their extraordinary work on this area，especially onβ2 adrenergic receptors.In this paper，we briefly reviewed the research progresses of G protein coupled receptors in the past，their unique 7transmembrane architecture，activation mechanism and their future trends.

G protein coupled receptor，adrenergic receptor，7 transmembrane architecture

10.3969／j.issn.0253-9608.2012.06.005

（編輯：沈美芳）