郭 敏，李 毅，馬彥軍

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

山生柳（Salix oritrepha）屬楊柳科柳屬多年生灌木，主要分布于海拔3 000～3 700m的高山山脊、山坡［1］，是高寒灌叢群落的主要優(yōu)勢(shì)種之一，常與高山繡線菊（Spiraea alpina）、金露梅（Potentilla fruticosa）、沙棘（Hippophae rhamnoides）、甘肅杜鵑（Rhododendron potaninii）、窄葉鮮卑花（Sibiraea angustata）、錦雞兒（Caragana sinica）等組成高寒灌叢［2］。山生柳也是防護(hù)林、薪炭林、水土保持林及用材林的重要造林樹(shù)種，是重要的能源林樹(shù)種，具有較高的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［3］。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）分子標(biāo)記是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的建立在PCR精確擴(kuò)增基礎(chǔ)上的第二代分子標(biāo)記［4］。SSR分子標(biāo)記技術(shù)在小麥（Triticum aestivum）［5］、水稻（Oryza sativa）［6］、大豆（Glycine max）［7］等農(nóng)作物基因圖譜的建立上的應(yīng)用已初具成效。近幾年來(lái)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)“東祁連山高寒灌叢生態(tài)系統(tǒng)特征及放牧管理策略”項(xiàng)目組對(duì)祁連山脈的山生柳資源進(jìn)行了較多研究，并對(duì)分布于張掖境內(nèi)核桃溝的山生柳進(jìn)行了梯度式考察取樣并作了細(xì)致的群落調(diào)查［8－9］。目前，在分子方面對(duì)高寒山生柳遺傳多樣性及基因漂流方面的研究相對(duì)較少，高效的山生柳SSR－PCR反應(yīng)體系及其優(yōu)化方法的研究也未見(jiàn)報(bào)道。鑒于以上因素，本研究測(cè)試和優(yōu)化山生柳SSR－PCR反應(yīng)體系中每個(gè)組合及成分的濃度，利用正交設(shè)計(jì)分析法，及單一因素分析法建立并優(yōu)化適宜山生柳遺傳分析的高效穩(wěn)定的SSR－PCR技術(shù)體系，以期為SSR標(biāo)記在山生柳的遺傳多樣性分析、功能基因比較、重要性狀定位等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)和提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 樣地設(shè)置與取樣方法 在全面勘察祁連山山生柳分布情況的基礎(chǔ)上，選擇山生柳分布較為廣泛的祁連山自然保護(hù)區(qū)作為試驗(yàn)區(qū)，首先在海拔2 800～3 500m范圍內(nèi)設(shè)樣線，在各樣線上沿海拔梯度大約每100m設(shè)置16m×16m的樣地1塊。然后在各地內(nèi)，對(duì)山生柳進(jìn)行取樣。

取樣時(shí)，分別取健康植株當(dāng)年生枝條上的嫩葉、嫩芽和種子，供后續(xù)DNA檢測(cè)用。所有材料均用液氮保存帶回。SSR－PCR體系優(yōu)化選取4個(gè)海拔梯度進(jìn)行，海拔從高到低依次為：1號(hào)取樣地（P1），海拔3 520m；3號(hào)取樣地（P3），海拔3 380m；5號(hào)取樣地（P5），海拔3 281m；7號(hào)取樣地（P7），海拔3 220m。引物設(shè)計(jì)來(lái)自 http：／／www．ornl．gov／sci／ipgc／ssr＿resource．htm（USA），由北京天埂集團(tuán)公司合成。

1．2 山生柳不同組織基因DNA的提取及比較 采用CTAB法對(duì)不同海拔梯度山生柳基因組DNA 進(jìn)行 提?。?0］，提取 了嫩芽、嫩葉、種 子的DNA，以期選取最優(yōu)質(zhì)的DNA。用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)其質(zhì)量，稀釋到所需濃度后置于－20℃冷藏。

1．3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) PCR的預(yù)擴(kuò)增程序參考馮亮亮等［11］的試驗(yàn)步驟，稍作改動(dòng)。94℃先預(yù)變性45s，然后94℃變性30s，引物SHUK123退火溫度56℃，退火45s，再72℃延伸10min，循環(huán)數(shù)30個(gè)，最后72℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物需盡快電泳，否則在4℃進(jìn)行保溫。用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠，用固定液，銀染液處理膠片檢測(cè)PCR的產(chǎn)物［12］。

表1 SSR反應(yīng)體系中各因素及其水平Table 1 Factors and levels in SSR reaction

1．4 SSR－PCR體系優(yōu)化 采用P1海拔的山生柳母本DNA為體系優(yōu)化模板，P2、P3、P4為檢驗(yàn)?zāi)０?。引物SHUK123上游：ATCGCATTTGTTCTTGAATCT；下游：GCTTAGGGTCTCTGTGGTGAG。選用L9（34）正交設(shè)計(jì)（表2），結(jié)合單因子試驗(yàn)對(duì)PCR反應(yīng)的Taq酶、Mg2＋、dNTPs、模板濃度4個(gè)因素的3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)［13］，并對(duì)反應(yīng)的擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)PCR反應(yīng)的變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間、循環(huán)數(shù)4個(gè)因素的3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)（表3）。對(duì)正交結(jié)果和單因素得到的結(jié)果進(jìn)行綜合性直觀分析，得到山生柳SSR－PCR反應(yīng)各因素的最佳水平。

1．4．1 SSR－PCR 各組分體系優(yōu)化正交試驗(yàn) 依照L9（34）正交表（表2）對(duì)4個(gè)因素的3個(gè)不同水平進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)每個(gè)水平的處理進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)3次。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳［14］跑膠，并染色拍照保存，供后續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。

1．4．2 單因子試驗(yàn) 在單因子反應(yīng)中采用的初始反應(yīng)體系，各組分添加濃度：0．5μmol·L－1上下游引物各2μL；DNA 模板1μL，30ng左右；0．5U 的Taq聚合酶1μL；2．5mmol·L－110×PCR Buffer 2μL；0．2mmol·L－1dNTPs 2．5mmol·L－1Mg2＋；加ddH2O調(diào)整體系最終體積至20μL。

在SSR－PCR反應(yīng)體系中分別對(duì)4個(gè)因素的影響進(jìn)行分析（表1），每個(gè)組合設(shè)3個(gè)重復(fù)。每當(dāng)其中一種水平進(jìn)行變化時(shí)，體系中其他成分的水平保持不變。產(chǎn)物電泳檢測(cè)方法和擴(kuò)增的程序與正交試驗(yàn)相同。對(duì)跑膠的結(jié)果進(jìn)行直觀評(píng)價(jià)，同時(shí)將單因子試驗(yàn)的結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合分析比較，從而在正交和單因子水平兩個(gè)方面建立山生柳SSR－PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系。

表2 PCR反應(yīng)體系組分的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Orthogonal design of PCR reaction system

1．4．3 SSR－PCR 擴(kuò)增程序優(yōu)化的正交試驗(yàn) 在SSR－PCR反應(yīng)中，PCR擴(kuò)增時(shí)的關(guān)鍵因素，如變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間及循環(huán)數(shù)對(duì)擴(kuò)增的優(yōu)劣起到了重要的作用。采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，本試驗(yàn)的擴(kuò)增程序優(yōu)化同樣選用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表 4）。產(chǎn)物檢測(cè)方法與1．4．2相同，對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，從而確定最終的PCR反應(yīng)程序。

1．4．4 退火溫度的優(yōu)化 引物SHUK123的退火溫度確定為（55±4）℃，設(shè)退火梯度（不同退火溫度分別設(shè)置），PCR儀自動(dòng)形成1～12個(gè)梯度，確定最佳退火溫度。

2.1 陰道鏡診斷與組織病理診斷結(jié)果的比較 98例病理診斷典型病例中，慢性宮頸炎7例(7.14%)，CIN 75例(76.53%，包括CINⅠ29例，CINⅡ28例，CINⅢ18例)，宮頸癌(均為宮頸鱗癌)16例(16.33%)。陰道鏡下對(duì)慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌的診斷符合率分別為100.00%、93.10%、89.29%、88.89%及100.00%。見(jiàn)表1。

表3 PCR擴(kuò)增程序中各因素及其水平Table 3 Factors and levels in the PCR procedure

1．4．5 上樣量對(duì)電泳檢測(cè)結(jié)果的影響 SSR－PCR體系建設(shè)的優(yōu)劣關(guān)鍵在于擴(kuò)增程序的掌控和反應(yīng)體系濃度的大小，與上樣量的多少?zèng)]有直接的關(guān)系。而本試驗(yàn)在進(jìn)行跑膠電泳檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)上樣量的大小對(duì)反應(yīng)的優(yōu)劣同樣起關(guān)鍵作用，于是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的上樣量做了6個(gè)不同的處理，分別為1～6μL，用于測(cè)定上樣量的不同對(duì)跑膠結(jié)果的影響。

2 結(jié)果

2．1 DNA提取結(jié)果 以嫩芽為材料所提的DNA量最多，沒(méi)有蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽及RNA等雜質(zhì)，質(zhì)量最好；嫩葉所提DNA量稍少于嫩芽，且有微量雜質(zhì)，可能由于山生柳屬于高海拔植物，其自身蠟質(zhì)含量高；種子提出的DNA量較少，含有少量蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，且RNA較多，質(zhì)量比嫩葉的差；果實(shí)所提的DNA量最少，雜質(zhì)最多，質(zhì)量最差（因?yàn)楣麑?shí)質(zhì)量很差，基本拍不出圖像，山生柳果實(shí)很難采取，不適合提取DNA）。試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1），嫩芽和嫩葉是提取DNA的最理想材料，并且在質(zhì)量和數(shù)量上均能滿(mǎn)足SSR擴(kuò)增的需要，其次為老葉、種子、果實(shí)。綜合上述，采用CTAB法可以提取高質(zhì)量的DNA。

圖1 3種材料山生柳組織DNA提取電泳圖Fig．1 Electrophoresis of DNA of three Salix oritrepha materials

2．2 反應(yīng)組分正交設(shè)計(jì)電泳結(jié)果 編號(hào)1、2、3、4、6、8的水平組合中都可以擴(kuò)增出譜帶，但編號(hào)1、2、3組合擴(kuò)增譜帶目標(biāo)帶不明顯，拖尾比較嚴(yán)重。同時(shí)編號(hào)4、6組合的譜帶較弱，幾乎看不清譜帶的擴(kuò)增情況。編號(hào)5、7、9的組合幾乎擴(kuò)增不出譜帶，一般可排除擴(kuò)不出目標(biāo)帶的組合認(rèn)為。編號(hào)8的組合擴(kuò)增譜帶最清晰且分辨率較高，綜合比較，編號(hào)8的擴(kuò)增帶最好，條帶清晰，非特異帶少，顏色較深，即Taq酶 1．0U·μL－1，Mg2＋2．0mmol·L－1，dNTP 0．1mmol·L－1，DNA 濃度 20ng·μL－1（圖3）。

圖2 不同海拔山生柳DNA電泳圖Fig．2 Electrophoresis of DNA of Salix oritrepha

圖3 SSR－PCR反應(yīng)正交設(shè)計(jì)電泳結(jié)果Fig．3 Electrophoresis of SSR－PCR by orthogonal design

2．3 單因子試驗(yàn)結(jié)果分析

2．3．1 Taq聚合酶對(duì)山生柳SSR－PCR 擴(kuò)增的影響

擴(kuò)增譜帶的依次減弱是因?yàn)槊傅挠昧坑兴鶞p少而導(dǎo)致的，Taq酶用量在0．5U時(shí)條帶最清晰且沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，從而確定Taq酶的最佳用量為0．5U（圖4）。

2．3．2 Mg2＋濃度對(duì)山生柳SSR－PCR擴(kuò)增的影響

圖4 反應(yīng)體系中各因素在不同濃度下對(duì)3 520m處山生柳PCR產(chǎn)物的影響Fig．4 Effects of factors in orthogonal design on the PCR production of Salix oritrepha from an altitude of 3 520m

2．3．3 dNTPs濃度對(duì)山生柳SSR－PCR擴(kuò)增的影響

3種不同濃度dNTPs下擴(kuò)增的結(jié)果優(yōu)劣有明顯差異，濃度過(guò)低會(huì)沒(méi)有譜帶（圖4）。因此，確定0．10 mmol·L－1為山生柳20μL反應(yīng)體系中的最佳濃度。

2．3．4 DNA濃度對(duì)山生柳擴(kuò)增的影響 隨著DNA模板濃度的升高，擴(kuò)增條帶彌散現(xiàn)象比較嚴(yán)重，同時(shí)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因而采用20ng·μL－1的DNA濃度即可。以上結(jié)果顯示，單因子試驗(yàn)可以對(duì)反應(yīng)體系中每一個(gè)因素的不同水平進(jìn)行比較直觀的分析，而對(duì)各個(gè)因素水平的組合實(shí)驗(yàn)可以利用正交設(shè)計(jì)。在單因子試驗(yàn)中，與正交試驗(yàn)相比，其余的組分濃度基本相同，只有酶的用量略有降低，為0．5U。綜合兩種試驗(yàn)結(jié)果，確定山生柳20μL SSR－PCR反應(yīng)體系中幾個(gè)關(guān)鍵的影響因子分別為0．5UTaq聚合酶，2．0mmol·L－1Mg2＋，0．10mmol·L－1dNTP，20ng·μL－1DNA模板。

2．4 反應(yīng)程序的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)電泳結(jié)果

SSR－PCR反應(yīng)程序正交設(shè)計(jì)9個(gè)組合的擴(kuò)增顯示（圖5），擴(kuò)增譜帶的深淺、優(yōu)劣不同，原因是變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間以及循環(huán)數(shù)的組合不同。編號(hào)2、3、6組合的譜帶較弱，編號(hào)4、5組合沒(méi)有擴(kuò)出目標(biāo)帶。編號(hào)1、7、8、9組合都可以擴(kuò)增出較清晰譜帶，但1、8、9組合擴(kuò)增背景不清，較彌散并且?guī)в须s帶，顏色較深。綜合正交試驗(yàn)結(jié)果和以往經(jīng)驗(yàn)，得出第7組為反應(yīng)程序最佳方案，即變性時(shí)間45s，退火時(shí)間45s，延伸時(shí)間30s，循環(huán)數(shù)30個(gè)。

圖5 SSR－PCR反應(yīng)程序的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)電泳結(jié)果Fig．5 Electrophoresis of SSR－PCR by orthogonal design

2．5 不同退火溫度的優(yōu)化 在梯度試驗(yàn)中引物SHUK123基本上均能擴(kuò)增出條帶，但在56℃時(shí)擴(kuò)增出的帶型整齊、清楚，特異帶明顯，無(wú)拖尾現(xiàn)象（圖6），此溫度與引物兩條鏈的較低的理論熔解溫度［Tm＝2（A＋T）＋4（G＋C）］相近。而在59℃時(shí)產(chǎn)生了一定的彌散現(xiàn)象，條帶拖尾比較嚴(yán)重。故采用56℃退火溫度即能得到很好的擴(kuò)增結(jié)果。綜上所述，山生柳優(yōu)化后的反應(yīng)程序：94℃高溫預(yù)變性時(shí)間3min，94℃變性45s，Tm退火時(shí)間45s，72℃延伸30s，循環(huán)數(shù)30個(gè)，最后72℃后延伸時(shí)間5min，4℃保溫。

2．6 不同上樣量對(duì)聚丙烯酰胺電泳結(jié)果的影響 在8%的丙烯酰胺凝膠上，上樣4μL以下的條帶由于染色背景較淺，擴(kuò)增的分子量相差較小，所以無(wú)法顯示。上樣量大于5μL時(shí)背景顏色太深，產(chǎn)生彌散效果。上樣5μL效果最好，條帶較清晰，區(qū)分度強(qiáng)，目標(biāo)帶明顯（圖7）。因此最佳上樣量最佳為5μL。

圖6 引物不同退火溫度的電泳圖Fig．6 Electrophoresis of SHUK123with different annealing temperatures

圖7 不同上樣量對(duì)聚丙烯酰胺電泳結(jié)果的影響Fig．7 Effects of loading amount on the polyacrylamide gel electrophoresis

2．7 體系優(yōu)化后的擴(kuò)增結(jié)果 綜上利用優(yōu)化后的SSR－PCR反應(yīng)體系對(duì)4個(gè)不同海拔山生柳材料進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，各海拔梯度的擴(kuò)增條帶均很清晰，每個(gè)泳道有譜帶15～22條，反應(yīng)體系的特異性、可重復(fù)操作性和穩(wěn)定性較好（圖8）。這表明不同海拔的山生柳品種優(yōu)化后的體系是穩(wěn)定可靠的。譜帶的豐富性從另一方面也反映了山生柳具有較豐富的遺傳多樣性。

圖8 用優(yōu)化體系對(duì)4個(gè)海拔梯度山生柳擴(kuò)增的結(jié)果Fig．8 Amplification results of Salix oritrepha from 4altitudes with optimized system

3 討論

山生柳是我國(guó)祁連山脈特有高寒防御樹(shù)種，篩選其SSR引物及建立優(yōu)化的反應(yīng)體系是SSR－PCR的關(guān)鍵所在，這也是SSR分子標(biāo)記多態(tài)性應(yīng)用的必要環(huán)節(jié)和基礎(chǔ)［15］。但在影響擴(kuò)增優(yōu)劣的各個(gè)影響因子中，由于SSR反應(yīng)體系所含組分比較繁多，各組分的含量大小和反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短均可能對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物及跑膠的優(yōu)劣產(chǎn)生影響［16］。所以本研究中采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因子試驗(yàn)綜合考慮的方法，可有效地節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間并節(jié)約成本，對(duì)SSR－PCR試驗(yàn)的有效性和嚴(yán)謹(jǐn)性提供了支持［17］。

PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率及譜帶的優(yōu)劣是反應(yīng)體系中各因素綜合作用的結(jié)果，各因素要綜合考慮。Taq酶用量是其中的重要因子，它直接影響擴(kuò)增結(jié)果和產(chǎn)物多態(tài)性的檢出率、重復(fù)性和有效性。Mg2＋濃度是影響Taq酶活性的主要因子，Mg2＋濃度過(guò)高會(huì)使非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物增加，過(guò)低則造成擴(kuò)增產(chǎn)物減少，甚至不能擴(kuò)增。這是因?yàn)镸g2＋是TaqDNA聚合酶的激活劑，其濃度的高低不僅影響引物與模板的結(jié)合效率和產(chǎn)物的特異性，而且還會(huì)影響酶的活性和擴(kuò)增的可靠性，所以Mg2＋的濃度大小直接影響了反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)率［18－19］。本研究結(jié)果是在2．0mmol·L－1時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物最清晰，Mg2＋為2．5mmol·L－1時(shí)擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定，由于高濃度Mg2＋影響了Taq酶的活性，所以適當(dāng)降低Mg2＋的濃度有助于擴(kuò)增的效果。

引物濃度和質(zhì)量也會(huì)直接影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的優(yōu)劣，如果引物濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，還會(huì)增加背景的彌散程度導(dǎo)致拖尾現(xiàn)象的產(chǎn)生［20］。濃度過(guò)高的dNTPs會(huì)競(jìng)爭(zhēng) Mg2＋，降低游離 Mg2＋濃度，從而導(dǎo)致擴(kuò)增效果不理想，而當(dāng)組分含量dNTPs的濃度過(guò)低時(shí)會(huì)影響SSR－PCR擴(kuò)增的效率。

在各種影響因素中，考慮適宜的退火溫度也是關(guān)鍵所在，它會(huì)影響反應(yīng)的準(zhǔn)確率和擴(kuò)增效果。退火溫度過(guò)低會(huì)促使引物二聚體的產(chǎn)生，雜帶太多，對(duì)結(jié)果分析產(chǎn)生影響。而當(dāng)退火溫度過(guò)高時(shí)，模板與引物在擴(kuò)增過(guò)程中不能積極退火，反應(yīng)遲緩無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行；擴(kuò)增結(jié)果顯示，有的引物（WPMS13、WPMS14）在退火溫度為55℃時(shí)沒(méi)有擴(kuò)增帶，退火溫度降到50℃時(shí)就能擴(kuò)增出產(chǎn)物。值得注意的是，引物在有些情況下沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)產(chǎn)物也是其多態(tài)性的體現(xiàn)。一般可以以Tm值為PCR退火溫度［21］。當(dāng)引物兩條鏈的Tm不同時(shí)，可以以平均值為準(zhǔn)或適當(dāng)降低其退火溫度也會(huì)得到很好的特異性條帶?？傊?，在SSR－PCR擴(kuò)增中，應(yīng)綜合考慮各因素的組分濃度和反應(yīng)時(shí)間，從而加強(qiáng)擴(kuò)增的有效性和結(jié)果檢驗(yàn)的真實(shí)性。

［1］ 吳海艷，馬玉壽，王彥龍，等．黃河源區(qū)山生柳灌叢草甸植物群落多樣性及植物量組成［J］．草業(yè)科學(xué)，2008，25（5）：55－59．

［2］ 王芳，陳文業(yè)，才讓卓瑪，等．高寒區(qū)山生柳硬枝扦插灰色系統(tǒng)理論分析研究［J］．草業(yè)科學(xué)，2010，27（9）：86－90．

［3］ 關(guān)傳友．中國(guó)植柳史與柳文化［J］．北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（社會(huì)科學(xué)版），2006，5（7）：8－15．

［4］ 解新明，盧小良．SSR和ISSR標(biāo)記及其在牧草遺傳與育種研究中的應(yīng)用前景［J］．草業(yè)科學(xué)，2005，22（2）：30－35．

［5］ 陳新民，何中虎，史建榮．利用SSR標(biāo)記進(jìn)行優(yōu)質(zhì)冬小麥品種（系）的遺傳多樣性研究［J］．作物學(xué)報(bào)，2003，29（1）：13－19．

［6］ 楊官品，張啟發(fā)．水稻——多拷貝微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析［J］．遺傳，1998，20（2）：27－30．

［7］ 海林，王克晶，楊凱．半野生大豆種質(zhì)資源SSR位點(diǎn)遺傳多樣 性 分 析 ［J］．西 北 植 物 學(xué) 報(bào)，2002，22（4）：751－757．

［8］ 李毅，胡自治，王志泰．東祁連山高寒地區(qū)山生柳種群分布格局研究［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2002，11（3）：49－54．

［9］ 王志泰．東祁連山高寒陰濕地區(qū)山生柳種群年齡結(jié)構(gòu)和空間分布格局［D］．蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001．

［10］ 劉恩英．簸箕柳×綿毛柳遺傳框架圖譜的構(gòu)建［D］．南京：南京林業(yè)大學(xué)，2008．

［11］ 馮亮亮，唐紅，李毅，等．甘肅紅砂不同種群遺傳多樣性的ISSR分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（1）：125－129．

［12］ 張道遠(yuǎn)，張?jiān)?，曹同．耐寒苔蘚植物DNA提取及優(yōu)化RAPD、ISSR 反應(yīng)體系 的建立 ［J］．中國(guó)沙 漠，2006，26（9）：827－831．

［13］ 易金鑫，侯喜林，冷月祥．茄子基因組DNA提取及RAPD－PCR體系的優(yōu)化［J］．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（3）：50－52．

［14］ Liu Y，Chen H Y，Wei Y T，et al．Construction of a genetic map and localization of QTLs for yield traits in tomato by SSR markers［J］．Progress in Natural Science，2005，15（9）：793－797．

［15］ 常宏，王漢寧，張金文，等．玉米品種真實(shí)性和純度鑒定的SSR標(biāo)記多重PCR體系優(yōu)化［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：204－211．

［16］ 沈紫微，陳本建，康俊梅，等．紅豆草ISSR體系優(yōu)化及其在航天誘變種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用［J］．草業(yè)科學(xué)，2010，27（12）：66－71．

［17］ 鄭軼琦，王志勇，郭海林，等．正交設(shè)計(jì)優(yōu)化假儉草SRAP－PCR反應(yīng)體系及引物篩選［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（4）：110－117．

［18］ 何慶元，吳萍，張曉紅，等．不同秋眠性苜蓿SRAP體系優(yōu)化及遺傳多樣性分析［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（2）：201－209．

［19］ 喬玉山，章鎮(zhèn)，房經(jīng)貴，等．李種質(zhì)資源ISSR反應(yīng)體系的建立［J］．果樹(shù)學(xué)報(bào)，2003，20（4）：270－274．

［20］ 王志勇，袁學(xué)軍，劉建秀，等．狗牙根SRAP－PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（3）：79－85．

［21］ 劉曉麗，何天明，張美勇，等．核桃SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化［J］．果樹(shù)學(xué)報(bào)，2007，24（2）：140－145．