孫治坤 馬興榮 楊紅旗 張杰文△

1）河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003 2）鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 3）河南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學部神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

在我國，隨著社會人口老齡化的進展，腦血管病的發(fā)病率也逐年增加，血管性癡呆（vascular dementia，VaD）已成為嚴重影響患者生活質(zhì)量的重要事件，美金剛（memantine）作為一種新型的N－甲基－D－天冬氨酸受體（NMDAR）拮抗劑，目前已被批準成為臨床上治療中、重度阿爾茨海默病的藥物［1］，研究表明，臨床上美金剛對VaD患者的認知功能也有一定改善作用，但目前對其作用機制研究甚少。張曉鋒等［2］研究認為，美金剛有可能通過增加VaD大鼠腦內(nèi)BDNF含量保護海馬神經(jīng)元等改善學習記憶能力。本研究通過觀察美金剛對VaD大鼠模型腦組織內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽（GSH）活性的影響，探討其在血管性癡呆中的作用機制。

1 材料和方法

1．1 實驗動物分組及模型的建立 健康12～14月齡 Wistar大鼠，體質(zhì)量300～400g，由河南省實驗動物中心所提供；雌雄不拘。動物購回后飼養(yǎng)3d，觀察無異常，用 Morris水迷宮篩選出較靈活的大鼠80只，將大鼠隨機分為對照組、模型組、美金剛對照組及美金剛治療組，每組20只。大鼠術(shù)前12h禁食，4h禁水。用10%水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉，保證手術(shù)期間有自主呼吸。模型組及美金剛治療組大鼠仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，分離出雙側(cè)頸總動脈，雙重絲線結(jié)扎，術(shù)中大鼠肛溫保持在36．5～37．5℃，手術(shù)后動物送至有通風和空調(diào)設備的動物房飼養(yǎng)。對照組大鼠除不結(jié)扎頸總動脈外，麻醉方法及手術(shù)過程均與模型組相同。術(shù)后7d行Morris水迷宮檢測，以對照組大鼠游到平臺平均時間的95%上限值為標準，將超出上限值的模型組大鼠確定為血管性癡呆大鼠。美金剛對照組和美金剛治療組于術(shù)后8周開始給予美金剛治療（5mg·kg－1）（溶于2mL的0．5g／L羧甲基纖維素鈉中）灌胃，1次／d，連續(xù)進行4周。對照組及模型組分別灌以等量0．5g／L羧甲基纖維素鈉。

1．2 行為學檢測 采用中國醫(yī)學科學院生產(chǎn)的 Morris水迷宮，檢測大鼠術(shù)前及術(shù)后不同時間內(nèi)水迷宮學習成績。Morris水迷宮由圓形的水池、自動攝像和分析系統(tǒng)組成。檢測指標：（1）定位航行實驗：利用 Morris水迷宮對大鼠進行行為學訓練和測試。水迷宮裝置為一圓形水池（水池壁為黑色），直徑120cm，水深30cm，加入黑色食用色素使水不透明，水溫保持在22℃左右，將迷宮均分為4個象限，一黑色圓形平臺（直徑9cm）位于第二象限水面下1～2cm。實驗訓練階段為4d，每只大鼠接受訓練4次／d，訓練180s／次，2次訓練間隔為30s，每次訓練的入水點為按隨機序列排列的4個象限，每相鄰2d的入水順序不同。如果大鼠在180s內(nèi)上臺，則允許其在平臺停留30s；如果動物在180s內(nèi)不能發(fā)現(xiàn)平臺，則將其牽引至平臺并使其停留30s（其潛伏期定為180s）。用攝像頭跟蹤并記錄大鼠在水池中的游泳軌跡，并將數(shù)據(jù)輸入計算機中計算大鼠達到平臺的潛伏期及游泳距離。（2）空間搜索實驗：用于測量學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力，實驗第5天撤除平臺。分兩次將大鼠從距離原平臺位置（第二象限）較遠的兩個象限放入水中，記錄并分析大鼠在第二象限內(nèi)的時間百分比和游泳距離百分比。

1．3 大鼠皮層、海馬組織AChE、ChAT、MDA、GSH活性檢測 將大鼠斷頭取腦，在冰盒上剝離皮層與海馬組織，稱質(zhì)量后置于液氮中冷凍，之后加入預冷的0．9%生理鹽水，Biorad蛋白定量。（1）AChE活性檢測：AChE水解乙酰膽堿生成膽堿及乙酸，膽堿可以與巰基顯色劑反應生成TNB（對稱三硝基苯，Sym－Trinitrobenzene）黃色化合物，根據(jù)顏色深淺進行比色定量，水解產(chǎn)物膽堿的數(shù)量可反映膽堿酯酶的活力。在412nm處測吸光度值，AChE活性以U·mg－1Pro表示。（2）ChAT活性測定：以乙酰輔酶A和膽堿為底物，在ChAT的作用下，反應的生成物和顯色劑結(jié)合，在324nm處測定吸光度，ChAT的活性以U·mg－1Pro表示。（3）MDA活性測定：過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在523nm處有最大吸收峰。MDA活性以nmol·mg－1Pro表示。（4）GSH活性檢測：二硫代二硝基甲酸與巰基化合物反應時能產(chǎn)生一種黃色化合物，在412nm測吸光度值。GSH活性以mg·g－1Pro表示。具體操作按試劑盒說明進行。

1．4 統(tǒng)計學處理 采用國際通用統(tǒng)計軟件SPSS 16．0進行數(shù)據(jù)處理。采用t表示，對結(jié)果進行方差齊性檢驗，符合條件后進行后續(xù)分析，多組數(shù)值間比較采用單因素方差分析，方差分析后多個樣本間比較用LSD法。取α＝0．05作為檢驗水準。

2 結(jié)果

2．1 美金剛對血管性癡呆大鼠的空間學習記憶能力的影響

2．1．1 定位航行實驗：訓練第1～3天，模型組動物的平均上臺潛伏期以及上臺前游泳距離與其他組無明顯差別；而且隨著訓練次數(shù)的增加，到達平臺的潛伏期及游泳距離不斷縮短。但到第4天，模型組大鼠的上臺潛伏期和游泳距離明顯高于對照組和美金剛治療組（P＜0．01），見Fig1A、Fig1B。

圖1A

圖1B

圖1Morris水迷宮訓練結(jié)果示美金剛對血管性癡呆大鼠的空間學習記憶能力的影響。A：各組大鼠訓練4天中平均上臺潛付期；B：各組大鼠訓練4天中上臺前游泳距離。（＊P＜0．05和對照組比較；＃P＜0．05和模型組比較）

2．1．2 空間搜索實驗：實驗第5天撤除平臺，模型組動物在平臺所在象限（第Ⅱ象限）中游泳的時間百分比和距離百分比明顯低于對照組（P＜0．05）和美金剛治療組（P＜0．05），見Fig2A、Fig2B。

圖2A

圖2B

圖2Morris水迷宮訓練結(jié)果示美金剛對血管性癡呆大鼠的空間學習記憶能力的影響。A：實驗第5天撤除平臺后，各組大鼠在平臺所在象限中游泳的時間面分比；B：實驗第5天撤除平臺后，各組大鼠在平臺所在象限中游泳的距離百分經(jīng)。（＊P＜0．05和對照組比較；＃P＜0．05和模型組比較）

2．2 美金剛對血管性癡呆大鼠模型的皮層、海馬AchE、ChAT、MDA、GSH活性的影響 與對照組相比，模型組大鼠腦皮層、海馬組織內(nèi)AChE活性明顯升高（P＜0．05）、ChAT活性明顯降低（P＜0．05）、MDA活性明顯升高（P＜0．05）、GSH活性明顯降低（P＜0．05）；與模型組相比，美金剛治療組大鼠腦皮層、海馬組織內(nèi)AChE及ChAT活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）、MDA明顯降低（P＜0．05）、GSH活性明顯升高（P＜0．05）。見表1。

表1 美金剛對血管性癡呆大鼠皮層、海馬AchE、ChAT、MDA、GSH活性的影響

3 討論

血管性癡呆是腦血管病的常見并發(fā)癥，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。其主要發(fā)病機制包括自由基損傷，興奮性氨基酸毒性等。因此，有效自由基清除劑及興奮性氨基酸抑制劑可延緩腦血管病的發(fā)生及發(fā)展，并有助于防治VaD［3－4］。臨床試驗證明，鹽酸美金剛治療中、重度AD有明顯療效，且不良反應較少，它具有提高學習能力、改善記憶力及保護腦功能的作用［1，5－6］。本研究采用雙重絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈制造血管性癡呆的大鼠模型，采用美金剛進行干預治療，水迷宮學習成績結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4d訓練，模型組大鼠的上臺潛伏期和游泳距離明顯高于對照組和美金剛治療組（P＜0．05）；而實驗第5天撤除平臺，模型組動物在平臺所在象限（第Ⅱ象限）中游泳的時間百分比明顯低于對照組（P＜0．05），并與美金剛治療組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。這提示雙重絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈能有效誘導大鼠出現(xiàn)行為學改變，表現(xiàn)為空間學習記憶功能障礙，可作為血管性癡呆大鼠模型使用，同時，我們的研究結(jié)果也表明美金剛治療后，可以明顯改善大鼠的學習記憶功能缺損。

乙酰膽堿（Ach）是中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它由ChAT合成，經(jīng)AchE分解，通過Ach受體發(fā)揮生物學效應，如果ChAT和AchE活性異常，將會引起Ach代謝失調(diào)，導致中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的改變。膽堿類遞質(zhì)參與了學習記憶過程，任何影響乙酰膽堿的合成、貯存及釋放的因素，均可造成顱內(nèi)乙酰膽堿水平的下降，從而影響記憶及認識功能，研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿的減少程度不僅和AD的嚴重程度呈正相關(guān)［7］，并且大鼠海馬Ach含量的持續(xù)降低，也是血管性癡呆發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一［8－9］。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠腦內(nèi)AchE活性升高，ChAT的活性明顯降低（P＜0．01），這與模型組大鼠水迷宮學習成績明顯下降具有明顯相關(guān)性；而美金剛治療組與模型組相比，AChE的活性及ChAT活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。

有資料顯示，VD的發(fā)病機制與氧化應激密切相關(guān)，體內(nèi)氧自由基過量，可引起組織過氧化損傷，是VD的重要因素之一［10］。MDA和GSH是與機體氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)的物質(zhì)，直接反映機體的氧化還原狀態(tài)。MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是評價衰老的重要指標之一，MDA水平的高低反應機體受自由基損傷的程度［11－12］。GSH在體內(nèi)廣泛存在，特異性催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用［13］。因此，我們對 MDA、GSH的改變進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組與對照組相比，MDA的活性明顯升高，GSH的活性明顯降低（P＜0．05）；同時，我們還發(fā)現(xiàn)，美金剛治療組MDA活性較模型組明顯降低（P＜0．05）；GSH 活性較模型組明顯升高（P＜0．05）。我們的結(jié)果表明，美金剛可明顯提高大鼠腦組織中GSH的含量，降低MDA的水平，在清除自由基、減輕自由基對機體的損害方面具有一定的作用。因此，我們的研究表明美金剛對血管性癡呆大鼠學習記憶功能的下降有明顯的治療作用，該作用與其抗氧化應激有關(guān)。

［1］Schmidt R，Baumhackl U，Berek K，et al．Memantine for treatment of behavioural disturbances and psychotic symptoms in moderate to moderately severe Alzheimer dementia：a naturalistic study in outpatient services in Austria［J］．Neuropsychiatr，2010，24（2）：125－131．

［2］張曉鋒，陳淅泠，王欣東 ．鹽酸類金剛對血管性癡呆大鼠海馬CAI區(qū)BDNF及ERK表達的影響［J］．中國實用神經(jīng)疾病雜志，2010，13（4）：19－21．

［3］Baskys A，Hou AC．Vascular dementia：pharmacological treatment approaches and perspectives［J］．Clin Interv Aging，2007，2（3）：327－335．

［4］Korczyn AD．Drugs for vascular dementia［J］．Lancet Neurol，2007，6（9）：749－751．

［5］Vidal JS，Lacombe JM，Dartigues JF，et al．Memantine thera－py for Alzheimer disease in real－world practice：an observational study in a large representative sample of French patients［J］．Alzheimer Dis Assoc Disord，2008，22（2）：125－130．

［6］宋亞楠，冀建偉 ．鹽酸類金剛治療阿爾茨海默病的療效觀察［J］．中國實用神經(jīng)疾病雜志，2009，12（6）：25－26

［7］Jia JP，Jia JM，Zhou WD，et al．Differential acetylcholine and choline concentrations in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer＇s disease and vascular dementia［J］．Chin Med J（Engl），2004，117（8）：1 161－1 164．

［8］Wang J，Zhang HY，Tang XC．Cholinergic deficiency involved in vascular dementia：possible mechanism and strategy of treatment［J］．Acta Pharmacol Sin，2009，30（7）：879－888．

［9］Di Lazzaro V，Pilato F，Dileone M，et al．In vivo functional evaluation of central cholinergic circuits in vascular dementia［J］．Clin Neurophysiol，2008，119（11）：2 494－2 500．

［10］Bennett S，Grant MM，Aldred S．Oxidative stress in vascular dementia and Alzheimer＇s disease：a common pathology［J］．J Alzheimers Dis，2009，17（2）：245－257．

［11］Lapenna D，Cuccurullo F．TBA test and"free"MDA assay in evaluation of lipid peroxidation and oxidative stress in tissue systems［J］．Am J Physiol，1993，265（3Pt 2）：1 030－1 032．

［12］Del Rio D，Stewart AJ，Pellegrini N．A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress［J］．Nutr Metab Cardiovasc Dis，2005，15（4）：316－328．

［13］Paamoni－Keren O，Silberstein T，Burg A，et al．Oxidative stress as determined by glutathione（GSH）concentrations in venous cord blood in elective cesarean delivery versus uncomplicated vaginal delivery［J］．Arch Gynecol Obstet，2007，276（1）：43－46．