儲 淼 孫立勝 蔣 青

(南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院關(guān)節(jié)中心，南京 210008)

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是膝關(guān)節(jié)內(nèi)的強(qiáng)大韌帶，對維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定至關(guān)重要，通過防止脛骨在股骨上向前移動或向后移動，同時防止膝關(guān)節(jié)過度伸直，限制內(nèi)、外旋和內(nèi)、外翻活動，是膝關(guān)節(jié)內(nèi)最容易損傷的韌帶［1，2］。ACL 斷裂后，使平衡能力和本體感覺下降，下肢肌肉的力量和功能也受到影響，使受傷下肢生物力學(xué)改變［3，4］，關(guān)節(jié)軟骨壓力傳導(dǎo)紊亂，增加了軟骨磨損，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退行性改變，最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［5，6］。本研究以3個年齡段(6、12、24個月)新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對象，通過檢測切除兔膝關(guān)節(jié)ACL后不同時間關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度，在病理學(xué)和含水率2個方面觀察年齡對ACL斷裂后軟骨損傷的影響，旨在探討處理不同年齡段患者ACL損傷的最佳方法和時機(jī)，為臨床防止或延緩膝關(guān)節(jié)軟骨退變的發(fā)生、發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

新西蘭大白兔30只(為排除性別差異，統(tǒng)一性別為雄兔)。6、12、24月齡各10只［南京市鼓樓醫(yī)院動物中心，SCXK(蘇)2007－0004］，按年齡分為A、B、C 3組。相同年齡的10只兔子，再隨機(jī)分為5組，每組2只。設(shè)置5個時間點(diǎn)，分別為術(shù)后5、10、15、20、25 周。雙側(cè)膝關(guān)節(jié)自身對照，切斷右膝關(guān)節(jié)ACL，以右側(cè)作為陽性對照側(cè)，左側(cè)膝關(guān)節(jié)僅行膝關(guān)節(jié)切開術(shù)，作為假手術(shù)陰性對照側(cè)。實(shí)驗(yàn)過程中對于動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 肌肉注射麻醉(30 g/L戊巴比妥，劑量0.03 mg/kg)后，將其固定在動物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺上。膝部剃毛，碘酒、酒精消毒皮膚，鋪洞巾，嚴(yán)格按無菌操作原則進(jìn)行手術(shù)。右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做切口至關(guān)節(jié)腔，切口長約3 cm，將髕骨、髕韌帶推向外側(cè)，屈曲膝關(guān)節(jié)，暴露ACL，用絲線拉起韌帶完全切斷，逐層縫合切口;同樣方法顯露左膝關(guān)節(jié)腔，但不切斷ACL，作為假手術(shù)陰性對照。沖洗關(guān)節(jié)腔后，1號絲線逐層縫合切口。術(shù)后1周所有實(shí)驗(yàn)動物每天肌注80萬U青霉素預(yù)防感染［7］。分籠飼養(yǎng)，每籠1兔，不做固定處理，自由進(jìn)食、活動，強(qiáng)迫兔子每日活動半小時，分2次驅(qū)趕。

1.2.2 標(biāo)本制作與大體觀察 ①大體觀察:分別于術(shù)后5、10、15、20、25周用空氣栓塞法處死各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)兔，解剖顯微鏡下觀察股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面軟骨改變，按以下原則評分［8］:0分:關(guān)節(jié)面光整，色澤如常;1分:關(guān)節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗;2分:關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達(dá)軟骨表、中層:3分:關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損深達(dá)軟骨深層;4分:軟骨剝脫，軟骨下骨質(zhì)暴露。②軟骨標(biāo)本的制作:手術(shù)取下膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)髁，固定于10%中性福爾馬林液中3 d，15%EDTA脫鈣、依次酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，切片。

1.2.3 Masson染色步驟 常規(guī)脫蠟至蒸餾水洗，蘇木素染5～10 min，流水沖洗。1%鹽酸酒精稍分化，流水沖洗數(shù)分鐘返藍(lán)。麗春紅酸性品紅染液染5～10 min，蒸餾水快速沖洗。磷鉬酸溶液處理約5 min，不用水洗直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min。1%冰醋酸處理1 min。95%酒精、無水酒精快速脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。在南京大學(xué)模式動物研究所觀察Masson染色玻片。

1.2.4 軟骨生化檢查 在各時間點(diǎn)處死動物后立即取下兩側(cè)脛骨平臺全層軟骨，用濾紙吸干其表面水分，精確稱取濕重。丙酮脫水后在真空干燥器中室溫下干燥至恒重，精確稱其干重，計(jì)算含水率。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察評分結(jié)果

24月齡組的兔子20周和25周組各有1只實(shí)驗(yàn)動物死亡。觀察股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面處，ACL切斷陽性側(cè):術(shù)后5周時6、24月齡兔關(guān)節(jié)面略有粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗，12月齡兔可見關(guān)節(jié)面磨損較明顯;術(shù)后10周3組兔滑膜輕度充血增生，關(guān)節(jié)液量少許增多，透明，關(guān)節(jié)軟骨面出現(xiàn)表、中層的軟骨缺損;術(shù)后15周3組兔病變有加重趨勢，滑膜增生明顯，滑液量少但稍混濁逐漸，關(guān)節(jié)面粗糙、軟骨小裂隙增多、色澤灰暗，6、12月齡組有軟骨損傷達(dá)深層;術(shù)后20周軟骨病變更明顯，滑膜部分呈結(jié)節(jié)樣增生，滑液量少但混濁，12月齡組兔軟骨損傷較重，部分軟骨下骨暴露，有少量骨贅形成;術(shù)后25周關(guān)節(jié)面基本糜爛，軟骨缺損可深達(dá)軟骨中、深層，滑膜增生、破壞明顯，6月齡組和12月齡組可見軟骨剝脫，骨質(zhì)暴露，還有部分骨贅形成。與右側(cè)相比，假手術(shù)陰性對照側(cè)(左側(cè))的關(guān)節(jié)軟骨改變不明顯。表1為不同月齡組術(shù)后不同時間關(guān)節(jié)軟骨損傷的評分情況，3組術(shù)后不同時間軟骨退變有逐漸加重的趨勢，12月齡兔發(fā)展最快，基本每5周就進(jìn)展1級，術(shù)后20周時已經(jīng)到達(dá)最嚴(yán)重的4級，軟骨磨損嚴(yán)重，已有部分骨贅形成;6月齡兔進(jìn)展稍慢，術(shù)后25周時到達(dá)4級;24月齡兔進(jìn)展較慢，術(shù)后25周時仍未到達(dá)4級。

表1 關(guān)節(jié)軟骨損傷評分情況

2.2 軟骨Masson染色結(jié)果

圖1 術(shù)后5周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 6月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原綠染，表層軟骨細(xì)胞密集，表層略有不光整，軟骨細(xì)胞核深染，退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染。12、24月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè)表現(xiàn)與6月齡兔大致相同，但是從潮線升起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染的紅色火焰狀突起沒有6月齡明顯 Masson染色 ×40 圖2 術(shù)后10周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 6月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原綠染，表層不光整明顯;退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染，較術(shù)后5周時明顯且范圍廣布，可見軟骨表層纖維化。12、24月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè)表現(xiàn)與6月齡兔大致相同，12月齡兔切片中有較多血管翳從潮線通過，侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨Masson染色 ×40 圖3 術(shù)后15周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 24月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原淺綠染，疏松，表層不光整，有裂口，軟骨表層纖維化;6月齡兔軟骨表面出現(xiàn)明顯的缺損;12月齡兔軟骨丟失嚴(yán)重 Masson染色 ×40 圖4 術(shù)后20周時從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 24月齡ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原淺綠染，血管翳稍有增多，簇集細(xì)胞出現(xiàn)頻率增加較之15周時變化略有增加;6月齡與12月齡兔軟骨損傷加重，軟骨纖維化與血管翳增生更為明顯 Masson染色 ×40圖5 術(shù)后25周從左至右依次為6、12、24月齡兔右側(cè)(陽性對照側(cè))ACL切斷Masson染色切片 24月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原淺綠染，疏松且紊亂，潮線模糊不清。6、12月齡兔軟骨損傷更為嚴(yán)重，尤其是12月齡兔，損傷最為嚴(yán)重，軟骨殘余量少，大部分磨損、纖維化，細(xì)胞數(shù)少，鈣化層難以分辨 Masson染色 ×40

①術(shù)后5周時關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖1。6月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原綠染，表層軟骨細(xì)胞密集，表層略有不光整 ，軟骨細(xì)胞核深染，退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染。12、24月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè)表現(xiàn)與6月齡兔大致相同，但是從潮線升起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染的紅色火焰狀突起沒有6月齡兔明顯。②術(shù)后10周時關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖2。6月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原綠染，表層不光整明顯;退變軟骨從潮線升起很多紅色火焰狀的突起使未鈣化軟骨出現(xiàn)紅染，較5周時明顯且范圍廣布，可見軟骨表層纖維化。12、24月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè)表現(xiàn)與6月齡兔大致相同，12月齡兔切片中有較多血管翳從潮線通過，侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨。③術(shù)后15周時關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖3。24月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原淺綠染，疏松，表層不光整，有裂口，軟骨表層纖維化:6月齡兔軟骨表面出現(xiàn)明顯的缺損;12月齡兔軟骨丟失嚴(yán)重。④術(shù)后20周時關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖4。24月齡ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原淺綠染，血管翳稍有增多，簇集細(xì)胞出現(xiàn)頻率增加較之15周時變化略有增加;6月齡與12月齡兔軟骨損傷加重，軟骨纖維化與血管翳增生更為明顯。⑤術(shù)后25周時關(guān)節(jié)軟骨Masson染色結(jié)果見圖5。24月齡兔ACL切斷陽性對照側(cè):軟骨膠原淺綠染，疏松且紊亂，潮線模糊不清。6、12月齡兔軟骨損傷更為嚴(yán)重，尤其是12月齡兔，損傷最為嚴(yán)重，軟骨殘余量少，大部分磨損、纖維化，細(xì)胞數(shù)少，鈣化層難以分辨。

2.3 含水率的測定

3組各時間點(diǎn)軟骨含水率見表2。ACL切斷的右側(cè)軟骨含水率基本上比左側(cè)高，隨著軟骨損傷從輕到重的發(fā)展，右側(cè)(ACL切斷，陽性對照側(cè))軟骨含水率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。6、12月齡組兔軟骨損傷速度較快，所以在10～15周時出現(xiàn)含水率從高點(diǎn)下降的趨勢，而24月齡兔軟骨損傷慢，在20～25周時才出現(xiàn)。

表2 不同年齡組ACL切斷術(shù)后不同時間點(diǎn)左、右兩側(cè)軟骨含水率 %

3 討論

ACL損傷多發(fā)生在處于非功能位的膝關(guān)節(jié)，大部分發(fā)生在足球、籃球、滑雪等運(yùn)動中，當(dāng)人體在進(jìn)行急停、扭轉(zhuǎn)、落地或者剪切運(yùn)動時。當(dāng)膝關(guān)節(jié)由屈曲40°主動伸至完全伸直時，脛骨過度內(nèi)旋時，膝關(guān)節(jié)過度外翻及內(nèi)翻時，ACL承受最高的負(fù)荷［9］。ACL損傷后，膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨繼發(fā)性損傷，尤以關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙的股骨內(nèi)髁負(fù)重區(qū)處極易出現(xiàn)軟骨磨損，主要是因?yàn)橄リP(guān)節(jié)不穩(wěn)定，ACL防止膝關(guān)節(jié)內(nèi)旋作用消失，運(yùn)動時關(guān)節(jié)的應(yīng)力中心改變，脛股關(guān)節(jié)面出現(xiàn)剪力作用［10，11］。膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能，導(dǎo)致活動能力降低，生活也受到影響［12，13］，而且長期以往增加了患膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險［14］。軟骨損傷主要還受到年齡因素的影響，不同年齡段，在發(fā)生ACL斷裂后，軟骨損傷的程度會不一樣。

本研究通過對6、12、24個月3個不同年齡組的新西蘭大白兔進(jìn)行研究，比較不同年齡兔ACL斷裂后的軟骨損傷情況。不論是從大體的觀察、評分，還是從Masson染色病理切片的觀察，隨著時間的推移，3個年齡段的兔軟骨損傷有明顯不同的變化。12月齡兔子軟骨損傷最重，到術(shù)后25周時已經(jīng)有骨關(guān)節(jié)炎的表現(xiàn);6月齡兔次之，24月齡兔軟骨損傷進(jìn)展最慢，磨損最輕。6月齡兔因?yàn)槟贻p，自身軟骨有較強(qiáng)的修復(fù)作用，如果時間繼續(xù)延長，肯定會到達(dá)最嚴(yán)重的軟骨破壞，導(dǎo)致嚴(yán)重骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。ACL是膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，損傷后導(dǎo)致股骨、脛骨在負(fù)重時易半脫位，使膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，造成膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)面間接觸面積及壓力改變，致半月板和軟骨損傷。半月板損傷后，其對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用轉(zhuǎn)變?yōu)榧羟泻湍p作用，使軟骨發(fā)生軟化、龜裂、剝離、脫落，受到破壞的軟骨對半月板也會產(chǎn)生一些損害作用，形成惡性循環(huán)，時間越長，軟骨損傷越嚴(yán)重［9，15，16］。ACL 損傷致關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，軟骨受力不均勻，易誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞生理性的改變，甚至發(fā)生凋亡，從組織學(xué)上可見膠原纖維、蛋白多糖減少。在關(guān)節(jié)運(yùn)動中因磨損會產(chǎn)生一些微小顆粒，引起關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜反應(yīng)，使關(guān)節(jié)液中出現(xiàn)腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素，加劇了軟骨的損傷［17～20］。

關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。軟骨基質(zhì)主要包括膠原纖維、蛋白多糖和水，三者的有機(jī)結(jié)合使關(guān)節(jié)軟骨具有承受負(fù)荷，抵抗應(yīng)力、張力及減少摩擦的作用，水在其中所占的比例最大。關(guān)節(jié)軟骨中的水有利于營養(yǎng)和廢物的彌散、交換。本研究結(jié)果顯示在每組每個時間點(diǎn)，ACL切斷陽性對照側(cè)軟骨含水率比陰性對照側(cè)高，而且在3個年齡組中，隨著軟骨損傷從輕到重的發(fā)展，ACL切斷陽性對照側(cè)軟骨含水率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。軟骨中的水分為游離水和結(jié)合水兩部分，游離水主要由關(guān)節(jié)腔滲透進(jìn)入，滲透壓的大小與蛋白多糖的數(shù)量有關(guān);后者與膠原或蛋白多糖內(nèi)靠著兩者之間的水合作用結(jié)合［21］。在軟骨破壞較輕階段，一方面由于軟骨結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致膠原纖維結(jié)構(gòu)改變，膠原蛋白含量下降，這些結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致軟骨腫脹，增加了滲透壓，從而導(dǎo)致高滲吸水，引起滲透壓的持續(xù)增大，含水率的增加［22］。隨著軟骨磨損的越來越嚴(yán)重，由于新合成的蛋白多糖分子量較小，導(dǎo)致蛋白多糖與膠原生物學(xué)性能降低，同時炎癥介質(zhì)釋放減少，組織腫脹減輕，水合作用降低，含水率逐漸減小。含水率這一特點(diǎn)也可以使之成為檢測軟骨損傷程度的指標(biāo)。陰性對照側(cè)的膝關(guān)節(jié)軟骨也有輕度改變，可能是因?yàn)樵搨?cè)進(jìn)行了關(guān)節(jié)切開手術(shù)，手術(shù)造成出血、損傷、積血，各種因素激發(fā)的炎癥反應(yīng)引起了關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)激反應(yīng)［23］。

本研究使用新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動物，兔膝關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)組成、負(fù)重情況、生物力學(xué)和人有較大差別，而且本實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量有限，無法得出完全肯定的結(jié)論，但本實(shí)驗(yàn)顯示的膝關(guān)節(jié)軟骨損傷和年齡的關(guān)系與人可能有一定的共性，可供臨床參考。

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