王 瑩，吳雪瓊，于 庭

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春 130041；2.解放軍第309醫(yī)院 全軍結(jié)核病研究所，北京 100091）

活動性結(jié)核病患者全血干擾素誘導(dǎo)蛋白10測定及免疫狀態(tài)的研究

王 瑩1，2，吳雪瓊2＊，于 庭1＊

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長春 130041；2.解放軍第309醫(yī)院 全軍結(jié)核病研究所，北京 100091）

目的 研究全血干擾素誘導(dǎo)蛋白10（interferon-inducible protein 10，IP-10）對活動性結(jié)核病的輔助診斷價值及活動性結(jié)核病患者免疫狀態(tài)。方法分別應(yīng)用植物血凝素、純化的結(jié)核分枝桿菌CFP10／ESAT6融合蛋白刺激人全血產(chǎn)生IP-10，用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測105例活動性結(jié)核病患者、52例非結(jié)核肺部疾病患者、29例健康對照者全血中IP-10水平；繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）確定其診斷活動性結(jié)核病的臨界值，并評價其診斷效能。結(jié)果活動性結(jié)核病組非特異性IP-10水平（868±513pg／ml）高于健康對照組（549±365pg／ml，P＜0.05）與非結(jié)核呼吸疾病組（738±459pg／ml，但P＞0.05）?；顒有越Y(jié)核病患者組結(jié)核特異的IP-10的水平為（287.16±236.49pg／ml），顯著高于非結(jié)核呼吸疾病組（56.35±20.54pg／ml，P＜0.001）和健康對照組（52.20±28.28pg／ml，P＜0.001）。活動性肺結(jié)核組全血中結(jié)核特異的IP-10水平（317±258pg／ml）顯著高于活動性肺外結(jié)核組（232±167pg／ml，P＜0.05）；活動性結(jié)核涂片抗酸桿菌染色陽性組結(jié)核特異的IP-10水平（302±283pg／ml）高于活動性結(jié)核涂片陰性組（285±218pg／ml，但P＞0.05）；活動性結(jié)核PPD皮試陽性組結(jié)核特異的IP-10水平（338±222pg／ml）顯著高于活動性結(jié)核PPD陰性組（241±105pg／ml，P＜0.05）。結(jié)核特異的IP-10診斷結(jié)核病的臨界值為89pg／ml，其靈敏度和特異性分別為85.7%和88.9%。結(jié)論活動性結(jié)核病患者免疫反應(yīng)增強，全血結(jié)核特異的IP-10檢測可能成為活動性結(jié)核病輔助診斷指標之一。

結(jié)核；γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10；免疫；診斷

（ChinJLabDiagn，2012，16：0240）

結(jié)核病是機體被結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的呼吸道傳染病。統(tǒng)計表明2008年全世界新增結(jié)核感染者890萬－990萬［1］，近年來肺結(jié)核發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)已居傳染病之首，早期診斷結(jié)核病對控制結(jié)核疫情至關(guān)重要。診斷結(jié)核病的金標準是檢出病原體，但是此種方法靈敏度低。因此，需要一種快速、準確的實驗室診斷方法。ESAT6和CFP10是從結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中分離出的兩種特異性分泌蛋白，有較強的免疫原性，它們主要存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，卡介苗及大多數(shù)其它分枝桿菌中則缺乏該蛋白［2］，因此可以用于鑒別結(jié)核菌感染者和卡介苗接種者。γ-干擾素釋放試驗（interferon gamma release assay，IGRA）是一種定量檢測全血在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT6和CFP10多肽刺激下釋放γ-干擾素（IFN-γ）水平的方法。目前已有被美國FDA批準應(yīng)用該原理的Quanti FERON-TB試劑盒，用于結(jié)核菌潛伏感染者的檢測［3］，但IGRA在免疫低下的患者中檢測的靈敏度較低［4］。近年來有文獻報道IP-10在活動性肺結(jié)核患者體內(nèi)的高水平表達［5］，Ruhwald M 等［6］研究表明活動性肺結(jié)核患者血漿中IP-10水平顯著高于IFN-γ，其檢測的靈敏度較高。因此，本研究應(yīng)用植物血凝素（PHA）、純化的結(jié)核分枝桿菌重組CFP10／ESAT6融合蛋白體外刺激全血后，檢測活動性結(jié)核病組與非結(jié)核呼吸疾病組及健康對照組中IP-10水平，研究其對活動性結(jié)核病的輔助診斷價值及活動性結(jié)核病患者的免疫狀態(tài)。

1 對象和方法

1.1 對象

1.1.1 試劑與儀器 CFP10／ESAT6融合蛋白由解放軍第309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所克隆、表達、純化，置－80℃保存?zhèn)溆?。植物血凝素（PHA）系SIGMA公司產(chǎn)品。細胞培養(yǎng)液為RPMI-1640培養(yǎng)基（Solarbio公司產(chǎn)品）添加10%小牛血清（杭州四季青公司產(chǎn)品）。γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白10試劑盒（包括IP-10捕獲抗體、IP-10檢測抗體和鏈親合素-辣根過氧化酶）為美國BD公司產(chǎn)品?；瘜W(xué)發(fā)光檢測儀為北京科美東雅發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 對象 （1）105例活動性結(jié)核病患者抗凝標本來源于解放軍第309醫(yī)院結(jié)核科2010年10月至2011年5月期間，根據(jù)我國1992年修訂的《結(jié)核病的診斷標準和分類》確診為活動性結(jié)核病的住院患者，其中肺結(jié)核患者73例，肺外結(jié)核患者32例（包括結(jié)核性胸膜炎患者15例、結(jié)核性腦膜炎9例、頸部淋巴結(jié)核患者4例、腎結(jié)核1例、乳腺結(jié)核1例、結(jié)核性腹膜炎1例和盆腔結(jié)核1例）。其中男性62例，女性43例，年齡14～83歲，平均40±19歲。

（2）52例非結(jié)核肺部疾病患者抗凝標本來源于解放軍第309醫(yī)院呼吸科同期入院的肺炎和肺氣腫等其他肺部疾病住院患者。其中男性27例，女性25例，年齡1－82歲，平均61±20歲。

（3）29例健康人抗凝標本同期選擇來自解放軍第309醫(yī)院2011年碩士研究生志愿者。其中男性19例，女性10例，年齡25－31歲，平均27±2歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗酸桿菌涂片 用接種環(huán)挑取標本（包括痰標本、胸腔積液標本、腦脊液標本）0.05－0.1ml，在玻璃片右側(cè)三分之二處均勻涂沫成2cm卵圓形膜?？顾崛旧?，光學(xué)顯微鏡鏡檢（目鏡10X，油鏡100X）。抗酸桿菌呈紅色，找到抗酸桿菌3－9條／100視野以上為抗酸桿菌陽性。

1.2.2 PPD皮膚試驗 吸取卡介苗 PPD 0.1ml（5IU），采用曼圖氏法注射于前臂掌側(cè)皮內(nèi)。于注射后72h由解放軍309醫(yī)院結(jié)核科醫(yī)務(wù)人員檢查注射部位反應(yīng)。若硬結(jié)橫徑及縱徑的平均數(shù)≥5 mm為陽性。

1.2.3 全血特異性抗原刺激培養(yǎng) 采集肝素鈉或枸櫞酸鈉抗凝血2－4ml，在4h內(nèi)進行檢測。每份標本設(shè)置3孔，加入24孔培養(yǎng)板中，分別為陰性對照不加任何刺激物，陽性對照加植物血凝素（PHA）至終濃度20μg／ml，檢測孔加結(jié)核特異的CFP10／ESAT6融合蛋白至終濃度20μg／ml，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱22－24h。

1.2.4 IP-10檢測 用包被液1∶250稀釋單克隆抗體，4℃包被過夜。次日用洗滌液PBST（含0.05%Tween20的PBS，pH7.0）洗滌3次，3min／次，加入10%小牛血清37℃封閉1h，洗滌3次，3min／次，用洗滌液稀釋抗原（1∶10稀釋培養(yǎng)上清和IP-10標準品），每孔100μl，37℃孵育2h，洗滌5次，3 min／次。用洗滌液稀釋IP-10檢測抗體及鏈親合素－辣根過氧化酶，37℃孵育1h后，洗滌7次，3 min／次。加入底物，室溫避光反應(yīng)5分鐘。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測儀讀取結(jié)果，根據(jù)IP-10標準曲線計算IP-10含量（pg／ml）。陰性孔系未刺激時IP-10的基礎(chǔ)水平；陽性孔系PHA非特異性刺激后的IP-10水平；受試者全血中結(jié)核特異的IP-10水平系檢測孔IP-10含量減去陰性孔IP-10含量。

2 結(jié)果

2.1 健康對照組、非結(jié)核呼吸疾病組、活動性結(jié)核病組全血中IP-10水平186例受試者全血加入結(jié)核特異性蛋白刺激后，通過化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法檢測健康對照組、非結(jié)核呼吸疾病組、活動性結(jié)核病組全血培養(yǎng)上清中IP-10結(jié)果見圖1、表1?；顒有越Y(jié)核病組外周血淋巴細胞數(shù)略高于非結(jié)核呼吸疾病組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三組未刺激孔的IP-10水平差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。活動性結(jié)核病組非特異性IP-10水平高于健康對照組（P＜0.05）與非結(jié)核呼吸疾病組（P＞0.05），非結(jié)核呼吸疾病組高于健康對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?；顒有越Y(jié)核病組結(jié)核特異的IP-10水平顯著高于非結(jié)核呼吸疾病組和健康對照組（P＜0.001），而健康對照組與非結(jié)核呼吸疾病組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 受試者全血培養(yǎng)結(jié)核特異的IP-10值分布

2.2 活動性結(jié)核病分組中全血IP-10水平結(jié)果見表2，活動性肺結(jié)核組全血中結(jié)核特異的IP-10水平顯著高于活動性肺外結(jié)核組（P＜0.05）；活動性結(jié)核病分組中涂片抗酸桿菌染色陽性組結(jié)核特異的IP-10水平與涂片陰性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；活動性結(jié)核病分組中PPD皮試陽性組結(jié)核特異的IP-10水平顯著高于PPD陰性組（P＜0.05）。

2.3 ROC曲線分析及各組IP-10結(jié)果判定

以敏感性為縱坐標、1－特異性為橫坐標繪制結(jié)核特異的IP-10的ROC曲線（圖3）。應(yīng)用軟件SPSS17.0計算IP-10的曲線下面積是0.906，標準誤是0.022，95%置信區(qū)間（0.863－0.949）。根據(jù)ROC曲線得出的IP-10的診斷臨界值（89pg／ml）判定結(jié)果，105例活動性結(jié)核病組中90例陽性，靈敏度為85.7%；29例健康對照組中2例（6.9%）陽性，52例非結(jié)核呼吸疾病組中7例（13.5%）陽性，總的特異性為88.9%。

表2 不同結(jié)核病組全血培養(yǎng)上清中IP-10水平

圖3 結(jié)核特異的IP-10ROC曲線

3 討論

目前應(yīng)用IGRA檢測結(jié)核感染者已取得較高的靈敏度及特異性，但對機體內(nèi)的結(jié)核桿菌感染是否處于活動性的診斷仍有待解決。IP-10是由IFN-γ所誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種趨化因子，它主要由活化的單核巨噬細胞、各種淋巴細胞等產(chǎn)生，并具有強大的招募T淋巴細胞、單核巨噬細胞的作用。IP-10不僅在體外可以誘導(dǎo)外周血單個核細胞（PBMC）表達IFN-γ，同時在體內(nèi)也可以募集Th1型細胞分泌IFN-γ，刺激炎癥組織局部產(chǎn)生IP-10，從而使IP-10的分泌不斷增強。雖然IFN-γ和IP-10差異的免疫學(xué)機制尚未完全闡明，但目前的研究表明IFN-γ可能是由特異性抗原呈遞細胞（APC）與特異性T細胞相互作用產(chǎn)生的；而IP-10是由許多細胞因子 （IL-1、IL-2、IFN-γ、IFN-a、TNF-a）的信號和受體介導(dǎo)的相鄰 T細胞的信號聯(lián)合誘導(dǎo)APC產(chǎn)生的。由于IP-10并不完全依賴于IFN-γ的表達，也可由不產(chǎn)生IFN-γ的T細胞亞群誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此，IP-10可能成為比IFN-γ更敏感的檢測 T 細胞識別 的工具［7，8］。Frahm M［9］等和Goletti D［10］等研究結(jié)果均表明應(yīng)用結(jié)核特異蛋白刺激全血后，以Quanti FERON-TB商品試劑盒作為對照，發(fā)現(xiàn)IP-10在鑒別結(jié)核感染者和非結(jié)核感染的健康人時，比IFN-γ具有更高的敏感性。但關(guān)于活動性結(jié)核病與非活動性結(jié)核呼吸疾病患者IP-10的比較研究國內(nèi)外尚未見報道。

人體初次感染MTB后，機體特異性T細胞被激活并釋放少量的細胞因子。當受試者全血受到結(jié)核特異性的蛋白刺激后，曾被MTB激活的記憶T細胞就會對這些特異性抗原產(chǎn)生反應(yīng)，發(fā)生增殖分化并釋放出大量IP-10。因此，本文的研究結(jié)果顯示活動性結(jié)核病組結(jié)核特異的IP-10水平顯著高于非結(jié)核呼吸疾病組和健康對照組，而健康對照組與非結(jié)核呼吸疾病組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IP-10是由單核巨噬細胞及各種淋巴細胞分泌，全血中淋巴細胞數(shù)可能影響其產(chǎn)生水平，本研究結(jié)果表明，活動性結(jié)核病組外周血淋巴細胞數(shù)盡管略高于非結(jié)核呼吸疾病組，但無統(tǒng)計學(xué)意義，說明IP-10只是由機體內(nèi)結(jié)核特異的、活化的T淋巴細胞分泌表達，而靜止的T淋巴細胞低表達或不表達?；顒有苑谓Y(jié)核組結(jié)核特異性IP-10水平顯著高于活動性肺外結(jié)核組，可能是肺外局部的MTB進入血循環(huán)量較少，外周血中特異性T淋巴細胞受MTB特異性抗原刺激較少所致?；顒有越Y(jié)核病分組中涂片陽性組結(jié)核特異的IP-10水平與涂片陰性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明結(jié)核特異性IP-10水平可能與體內(nèi)的結(jié)核菌含量無關(guān)?；顒有越Y(jié)核病分組中PPD皮試陽性組結(jié)核特異的IP-10水平顯著高于PPD陰性組，可能與機體的免疫狀態(tài)有關(guān)，他們均是已確診的活動性結(jié)核病患者，而PPD呈陰性反應(yīng)可能因為機體細胞免疫功能低下、重度結(jié)核或無反應(yīng)結(jié)核，導(dǎo)致結(jié)核特異的IP-10分泌減少。由于本文PPD陰性組例數(shù)較少（8例），我們將進一步研究兩者之間的關(guān)系。本研究通過ROC曲線確定IP-10臨界值為89pg／ml，它輔助診斷活動性結(jié)核病具有較高的靈敏度和特異性（分別為83.2%、88.9%），與Frahm M［9］等研究結(jié)果一致，其應(yīng)用IP-10診斷結(jié)核感染的靈敏度和特異性分別為84.1%、96.2%。由此可見，IP-10可能成為結(jié)核病輔助診斷和鑒別診斷的有用工具。

Ruhward M 等［4］應(yīng) 用 ESAT-6、CFP-10 和TB7.7蛋白刺激全血后，以Quanti FERON-TB商品試劑盒為對照，發(fā)現(xiàn)IP-10檢測結(jié)核感染者和非結(jié)核感染者的靈敏度和特異性高于IFN-γ，并且對于免疫功能低下或缺陷的人群檢測結(jié)核特異性IP-10的水平比IFN-γ更有意義。Ruhward M 等［11］認為應(yīng)用IP-10代替IFN-γ或者與IFN-γ聯(lián)合檢測可能對于結(jié)核感染的檢測、結(jié)核病輔助診斷和鑒別診斷更具有臨床價值。

本研究活動性結(jié)核病組、非結(jié)核呼吸疾病組和健康對照組中患者平均年齡差異較大（P＜0.05），可能患者年齡影響全血中IP-10水平。但每份標本均用PHA作為陽性對照孔，它是一種非特異性抗原，可非特異性地激活機體T淋巴細胞分泌細胞因子，已廣泛用于判斷機體的基礎(chǔ)免疫力。本研究活動性結(jié)核組非特異性IP-10水平顯著高于健康對照組，略高于非結(jié)核呼吸疾病組但無統(tǒng)計學(xué)差異；而非結(jié)核呼吸疾病組也略高于健康對照組卻無統(tǒng)計學(xué)意義，說明患者年齡對全血中IP-10釋放水平并無影響，且患者患病后機體細胞免疫均有所增強，尤其是活動性結(jié)核病患者更顯著，這可能與患者體內(nèi)MTB特異性抗原持續(xù)刺激，使特異性T淋巴細胞處于過度免疫反應(yīng)狀態(tài)有關(guān)。

Azzurri A等［12］的研究發(fā)現(xiàn)活動性結(jié)核病組無抗原刺激的全血的IP-10水平顯著高于結(jié)核潛伏感染組，認為IP-10可用于活動性結(jié)核病和結(jié)核潛伏感染的鑒別診斷，但Alessandri AL等［13］的研究結(jié)果卻顯示這兩組間并無顯著差異。由于本研究并未在健康對照組和非結(jié)核呼吸疾病組中檢測結(jié)核潛伏感染者，三組未刺激孔的IP-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），因此，無法判斷無抗原刺激的全血中IP-10的水平是否可用于活動性結(jié)核和結(jié)核潛伏感染的鑒別診斷。

通過對本研究結(jié)果分析表明，活動性結(jié)核病患者免疫反應(yīng)增強，結(jié)核特異的IP-10水平顯著高于非結(jié)核呼吸疾病患者和健康人，全血IP-10檢測可能成為結(jié)核病輔助診斷指標之一。今后我們將擴大樣本進一步研究全血IP-10和全血IFN-γ對活動性結(jié)核病的輔助診斷價值。

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The analysis of IP-10in human blood and the active tuberculosis patients＇immune states

WANGYing1，2，WUXueqiong2，YUTing1.（1.TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China；2.TuberculosisResearch Laboratory，The309thHospitalofPLA，Beijing100091，China）

ObjectiveTo exploit the value of interferon-inducible protein 10 （IP-10）in active tuberculosis＇s auxiliary diagnosis and immune status of the active tuberculosis patients.MethodsThere were 186human whole blood samples，105samples of active tuberculosis patients，52samples of non-tuberculous pulmonary disease patients and 29healthy controls，stimulated by PHA and purified fusion protein CFP10／ESAT6of mycobacterium tuberculosis respectively to produce IP-10.The level of IP-10was evaluated by chemiluminescence enzyme immunoassay.Then the receiver operating characteristic curve was drawn to determine the threshold of IP-10for diagnosis of active tuberculosis and to evaluate its diagnostic performance.ResultsThe non-specific IP-10levels of the active tuberculosis group（868±513pg／ml）was higher than that of the healthy control group（549±365pg／ml，P＜0.05）and that of the non-tuberculous pul-monary disease group（738±459pg／ml，butP＞0.05）.The specific IP-10level of active tuberculosis group（287.16±236.49pg／ml）was significantly higher than that of non-tuberculous pulmonary disease group（56.35±20.54pg／ml，P＜0.001）and that of the healthy control group（52.20±28.28pg／ml，P＜0.001）.The specific IP-10level of active tuberculosis group（317±258pg／ml）was significantly higher than that of the extra-pulmonary tuberculosis group（232±167pg／ml，P＜0.05）.The tuberculosis-specific IP-10level of the active tuberculosis acid-fast bacilli smear-positive group（302±283pg／ml）was higher than that of the active tuberculosis smear-negative group（285±218pg／ml，butP＞0.05）.The specific IP-10level of PPD the active tuberculosis tuberculosis skin test positive group（338±222pg／ml）was significantly higher than that of the active tuberculosis PPD-negative group （241±105pg／ml，P＜0.05）.The threshold of IP-10for diagnosis of tuberculosis was 89pg／ml and its sensitivity and specificity were 85.7%and 88.9%respectively.ConclusionThe immune response strengthens in tuberculosis patient and the whole blood tuberculosis special IP-10examination may become one of the active tuberculosis auxiliary diagnostic targets.

tuberculosis；interferon-inducible protein 10；diagnosis；immunity

R521

A

1007－4287（2012）02－0240－05

國家重大傳染病防治科技重大專項基金資助（2008ZX10003-001）；吉林省科技廳課題（ 200505115；201115079）

＊通訊作者

2011－04－13）