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        社區(qū)相關(guān)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子分型研究

        2012-11-05 09:23:32潘宏升荀鳳嬌田素飛褚云卓
        關(guān)鍵詞:耐甲氧西林分型

        潘宏升,荀鳳嬌,田素飛,年 華,褚云卓*

        (1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢 驗(yàn)科,遼寧 沈 陽110001;2.遼寧省第三人民醫(yī)院 檢 驗(yàn)科)

        目前,全球范圍內(nèi)由社區(qū)相關(guān)性耐甲氧西林金黃色 葡 萄 球 菌 (community-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus,CA-MRSA)引起的感染呈逐年上升趨勢(shì),CA-MRSA與醫(yī)院相關(guān)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(hospital-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus ,HAMRSA)存在許多不同,CA-MRSA多感染無相關(guān)危險(xiǎn)因素的健康人群,且發(fā)病年齡較輕[1]。研究發(fā)現(xiàn),HA-MRSA與CA-MRSA的mec A基因的葡萄球菌基因盒(staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)的基因型不同,HA-MRSA 多為Ⅰ-Ⅲ,CA-MRSA以Ⅳ、Ⅴ型為主[1]。本文應(yīng)用SCC-mec基因分型、SPA分型、多位點(diǎn)序列(MLST)分析等方法,從多個(gè)角度了解CA-MRSA的分子生物學(xué)特點(diǎn),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株來源 收集2007年1月至2008年9月門診及住院患者連續(xù)分離、不重復(fù)非痰標(biāo)本CAMRSA菌株5例,其中濃汁3份,血液2份,詳細(xì)情況見表1。

        1.1.2 主要試劑及儀器 細(xì)菌基因組提取試劑盒,博日生物技術(shù)有限公司;Tag酶及PCR相關(guān)試劑,寶泰克大連生物科技有限公司;PCR引物,上海生工有限公司合成;脈沖場(chǎng)凝膠電泳試劑,美國(guó)Bio-Rad生物科技有限公司;PCR9700(Gene Amp);脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad),HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱(上海);超速低溫離心機(jī)(貝克曼);紫外凝膠成像儀(美國(guó)Alpha Innotech)。

        表1 5株CA-MRSA菌株來源的基本情況

        1.2 方法

        1.2.1 DNA模板提取 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒,按照說明提取基因組DNA。

        1.2.2 SCCmec基因分型 引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)參數(shù)等參 照 文 獻(xiàn)[2]進(jìn) 行,ClassB 上 游 引 物:5’-TATTTTTGGGTTTCACTCGG-3’,下游引物:5’-CTCCACGTTAATTCCATTAATACC-3’;ClassC上 游 引 物:5’-GAACATTGTTACTTAAATGAGCG-3’,下 游 引 物:5’-TGAAAGTTGTACCCTTGACACC-3’;Type2上游引物:5’-ATTGCCTTGATAATAGCCTCT-3’,下游:5’-TAA AGGCATCAATGCACAAACACT-3’。

        1.2.3 基因序列分析 目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增陽性,片段大小與預(yù)計(jì)值相符,產(chǎn)物經(jīng)上海生工有限公司純化、測(cè)序,在GenBank比對(duì)確證,其中SPA分型的測(cè) 序 結(jié) 果 于 數(shù) 據(jù) 庫(kù) (http://www.ridom.de/spaserver/)中公布的重復(fù)序列進(jìn)行比較,根據(jù)排列方式及次數(shù)確定型別。

        1.2.4 多位點(diǎn)序列分型 擴(kuò)增7個(gè)管家基因,引物及反應(yīng)參數(shù)參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行,管家基因引物分別如下:arc-up:5’-TTGATTCACCAG CGCGTA TTGTC-3 ’, arc-dn: AGGTATCTGCTTCAATCAGCG;aro-up:5’-ATCGGAAATCCTATTTCACATTC-3’,aro-dn:5’-GGTGTTGTATTAATAACGATATC-3’;glp-up:5’-CATGGAACTGCAATCTTAATCC,glp-dn:5’-TGGTAAAATCG-CATGTCCAATTC-3’;gmk-up:5’-ATCGTTTTATCGGGACCATC-3’,gmk-dn:5’-TCATTAACTACAACGTAATCGTA-3’;pta-up:5’-GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG-3’,pta-dn:5’-GAVCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA-3’;tpi-up:5’-TCGGTCATTCTGAACGTCGTGAA-3’,tpidn:5’-TTTGCACCTTCTAACAATTGT AC-3’;yqi-up:5’-CAGCATACAGGACACCTATTGGC-3’ yqi-dn:5 ’-CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC-3’。測(cè)序結(jié)果提交數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.mlst.net),比較每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因,獲得序列號(hào)(ST),與已知的MRSA流行株進(jìn)行比較分析。

        2 結(jié)果

        2.1 SCCmec基因分型結(jié)果

        5株CA-MRSA克隆株,SCCmec基因型Ⅳ型為3株(60%),Ⅴ型為2株(40%)。

        2.2 多位點(diǎn)序列分型結(jié)果

        3株SCCmec基因型Ⅳ型克隆株為ST59(19-23-15-2-19-20-15);Ⅴ型克隆株1株為ST7(5-4-1-4-4-6-3),另1株未能成功進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型。

        2.3 SPA基因多態(tài)性分型結(jié)果

        3株SCCmec基因型Ⅳ型克隆株歸屬為t437型(r04-r20-r17-r20-r17-r25-r34),Ⅴ型克隆株歸屬為t163型(r04-r20-r17-r20-r17-r45-r16-r34)和t796型(r07-r23-r21-r17-r12-r23-r02-r12-r23)。

        表2 5株CA-MRSA基因分型結(jié)果

        3 討論

        自從1997年在紐約首次發(fā)現(xiàn)社區(qū)相關(guān)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)引起的感染以來,全球范圍內(nèi)關(guān)于CA-MRSA感染的報(bào)道接連不斷,其較強(qiáng)的傳播能力和定植能力及其攜帶的毒力基因?qū)τ诩膊〉陌l(fā)生、發(fā)展都起到了十分重要的作用,使其極易造成感染的暴發(fā)和流行,引起發(fā)病率和死亡率升高。

        目前,分子流行病學(xué)研究方法在揭示病原菌的進(jìn)化及遺傳特性,確定某一感染暴發(fā)流行菌株或相關(guān)基因來源,追蹤基因水平的轉(zhuǎn)移與播散,調(diào)查院內(nèi)耐藥性質(zhì)粒在不同細(xì)菌間播散等方面發(fā)揮重要作用。本研究確定應(yīng)用三種基因分型(PFGE、MLST及SPA)方法,全面揭示CA-MRSA流行株的基因型變化趨勢(shì)及流行病學(xué)特點(diǎn),同時(shí)還可以為臨床經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確確證CA-MRSA感染提供方法學(xué)依據(jù)。其中,PFGE方法是進(jìn)行染色體DNA分型,將基因組的整體基因片段進(jìn)行分析,主要應(yīng)用于近期內(nèi)引發(fā)感染疾病的菌株間同源性分析,其分辨能力強(qiáng),被譽(yù)為基因分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”;而 MLST揭示的是菌株長(zhǎng)期進(jìn)化、變異的結(jié)果,其主要優(yōu)勢(shì)在于己經(jīng)建立了大型數(shù)據(jù)庫(kù),可以直接將結(jié)果提交到國(guó)際網(wǎng)站,與已知的流行株進(jìn)行比較和分析,了解不同國(guó)家和地區(qū)間菌株的遺傳相關(guān)性[4];SPA基因分型方法是目前較有效地基因分型工具,操作方便快捷,從另一個(gè)角度描繪了CA-MRSA的進(jìn)化路線[5]。

        本次調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),3例SCCmecⅣ-t437型CA-MRSA菌株(P14、2997、E14)的 MLST基因型為ST59,均分離自沈陽及周邊地區(qū)社區(qū)發(fā)病患者,因皮膚軟組織感染而接受治療,與美國(guó)、新加坡及中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)廣泛傳播的CA-MRSA菌株屬于同一克隆株[6]。另外兩株 CA-MRSA 菌株為SCCmecⅤ-t796型菌株(b811),MLST基因型為ST7,SCCmecⅤ-t163型菌株(5896)MLST未分出結(jié)果,表明此兩株菌分別由不同菌株進(jìn)化而來,在本地區(qū)流行傳播,但目前相關(guān)報(bào)道較少,不排除境外攜帶者傳播的可能性,隨著國(guó)家和地區(qū)間經(jīng)濟(jì)文化交流的日益頻繁,將會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)CA-MRSA菌株間的互相“流通”,這就使得疾病的傳播和變異進(jìn)一步復(fù)雜化,對(duì)人群危害嚴(yán)重。

        細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性不斷增長(zhǎng)問題備受世界關(guān)注,雖然CA-MRSA菌株在基因結(jié)構(gòu)上僅攜帶對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的mec A基因,但相關(guān)資料表明CA-MRSA菌株對(duì)多重藥物敏感率呈逐年降低趨勢(shì)[6],本研究中的5株CA-MRSA菌株不僅對(duì)青霉素、紅霉素、頭孢西丁抗菌藥物完全耐藥,對(duì)克林霉素及頭孢呋辛耐藥率也較高,而且對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素也有不同程度耐藥,表明本地區(qū)發(fā)現(xiàn)的多重藥物敏感率下降的CA-MRSA克隆株在不斷進(jìn)化發(fā)展中,適應(yīng)能力在不斷提高。此外,不容忽視的是CA-MRSA菌株SCCmec基因片段相對(duì)小,更容易整合其他耐藥基因,很容易造成大規(guī)模的疾病流行,勢(shì)必將醫(yī)學(xué)界推向被動(dòng)局面,形勢(shì)不容樂觀。有必要對(duì)耐藥菌株進(jìn)行耐藥監(jiān)測(cè),注意耐藥譜變化,研究其耐藥機(jī)制,指導(dǎo)臨床正確選擇抗菌藥物,防止耐藥菌株擴(kuò)散。

        [1]Jenum PA,Walberg M,Rφnning EJ,et al.An outbreak of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection in a maternity ward[J].Tidsskr Nor Laeqeforen,2008,128(8):933.

        [2]Kunyan Zhang,Jo-Ann McClure,Sameer Elsayed,et al.Novel Multiplex PCR Assay for Characterization and Concomitant Subtyping of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Types I to V in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus[J].JCM,2005,5026.

        [3]Mark C,Enright,Nicholas P,et al.Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus[J].J Clin Microbiol,2000,38:1008.

        [4]Strommenger B,Braulke C,Heuck D,et al.spa Typing of Staphylococcus aureus as a Frontline Tool in Epidemiological Typing[J].J Clin Microbiol,2008,46:574.

        [5]范 紅.三株社區(qū)獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因分型研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2008,88:20.

        [6]Gorwitz RJ,Jernigan DB,Powers JH,et al.In the CDC-Convened Experts’Meeting on Management of MRSA in the Community[C].2006.Strategies for clinical management of MRSA in the community:summary of an experts’meeting convened by the Centers for Disease Control and Prevention.

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