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        快中子誘發(fā)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物效應(yīng)研究

        2012-08-18 02:18:50孔福全崔素珍鄭潔瑩馬南茹
        中國(guó)工程科學(xué) 2012年8期
        關(guān)鍵詞:存活曲線快中子中子

        楊 磊,王 瀟,孔福全,隋 麗,崔素珍,鄭潔瑩,馬南茹,趙 葵

        (中國(guó)原子能科學(xué)研究院,北京 102413)

        1 前言

        腫瘤是一種常見(jiàn)多發(fā)病,對(duì)人類(lèi)健康威脅很大,其中惡性腫瘤的死亡率相當(dāng)高,因此,如何有效地治療腫瘤是擺在我們面前的一項(xiàng)重要任務(wù)。惡性腫瘤的病因和臨床表現(xiàn)非常復(fù)雜,現(xiàn)主要采用外科手術(shù)、射線輻照和中西藥物等手段進(jìn)行治療。射線輻照曾經(jīng)只用光子射線,隨著電子加速器及其他技術(shù)的發(fā)展,療效雖有所改善,但其生物效應(yīng)總不如高LET射線,這些射線中,以快中子治癌的研究發(fā)展速度較快。

        中子是能夠釋放出直接電離粒子或引起核變化的非帶電粒子。在與組織物質(zhì)作用過(guò)程中產(chǎn)生帶電粒子,有一定能量的次級(jí)帶電粒子能夠引起電離和激發(fā),從而使機(jī)體組織受到損傷[1]。中子屬于高傳能線密度(linear energy transfer,LET)輻射,它對(duì)DNA的損傷比同劑量的 γ射線更“有效”[2],其細(xì)胞遺傳學(xué)效應(yīng)敏感。世界第一屆快中子放療基本理論與實(shí)際應(yīng)用會(huì)議于1970年在荷蘭召開(kāi),至今已開(kāi)過(guò)多次中子治癌國(guó)際專業(yè)會(huì)議,專家們對(duì)中子治癌的療效是肯定的[3]。1975年至1983年4月,日本對(duì)1016例癌癥患者進(jìn)行了快中子治療,以前用光子射線難治的一些癌癥,如喉頭癌、班氏肺癌、骨肉瘤和惡性黑色素癌等,現(xiàn)已取得較好的療效。美國(guó)費(fèi)米實(shí)驗(yàn)室從1976年開(kāi)始用快中子治癌的臨床研究,10年中共治療了1400名患者,對(duì)唾液腺癌和惡性黑色素癌的局部控制率比光子射線分別高1倍和2倍左右。可是后來(lái),美國(guó)放射治療腫瘤學(xué)組織(RTOG)對(duì)307例不能手術(shù)的頭頸部鱗癌進(jìn)行快中子臨床隨機(jī)研究,結(jié)果認(rèn)為,在局部控制率等指標(biāo)與光子組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別[4]。這表明快中子放療并不是對(duì)所有癌癥都有優(yōu)越性的。另外,幾個(gè)研究單位對(duì)同一癌癥患者采用快中子放療的效果不一致,原因是多方面的,它包括放療設(shè)備性能的差異、發(fā)射物理學(xué)參數(shù)條件的差異和對(duì)有關(guān)放射生物學(xué)因素掌握程度的不同等。

        用快中子代替光子射線治療,物理效應(yīng)基本相似,但其生物效應(yīng)則優(yōu)于光子射線:如相對(duì)生物效應(yīng)高,即殺滅相同細(xì)胞,快中子所需的吸收劑量比光子小;氧增比小,說(shuō)明快中子對(duì)缺氧細(xì)胞殺滅能力強(qiáng);另外,在細(xì)胞增殖過(guò)程中,光子對(duì)相對(duì)靜止期細(xì)胞不敏感,而快中子則無(wú)此限制[5]。本實(shí)驗(yàn)以14 MeV快中子照射體外培養(yǎng)的U251(人腦膠質(zhì)瘤)細(xì)胞,研究快中子輻照誘發(fā)U251細(xì)胞的相關(guān)生物效應(yīng)。

        2 材料與方法

        2.1 材料

        實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞系為人腦膠質(zhì)瘤(U251)細(xì)胞系,購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞中心(Cell Resource Center);MEM(Eagle’s minimum essential medium)培養(yǎng)基購(gòu)自邁晨科技公司;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司。

        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

        U251細(xì)胞在含10%胎牛血清(杭州四季青公司)、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中,置于37℃的5%CO2孵箱中培養(yǎng),保持飽和濕度。

        2.3 輻照條件及中子劑量測(cè)定

        用中國(guó)原子能科學(xué)研究院自行設(shè)計(jì)的高壓倍加器所產(chǎn)生的中子束照射所有細(xì)胞樣本。所用的反應(yīng)為:

        反應(yīng)產(chǎn)生14 MeV中子。

        實(shí)驗(yàn)組設(shè)1、3、5、7 Gy共4個(gè)劑量點(diǎn),另設(shè)置對(duì)照組,除不接受照射外,其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同。

        以記錄伴隨α粒子的方法檢測(cè)中子,再算出細(xì)胞樣本的吸收劑量。

        2.4 成克隆方法檢測(cè)細(xì)胞存活率

        通過(guò)測(cè)量受不同輻射劑量照射后,有增殖能力的細(xì)胞的集落形成能力,即存活率隨劑量的變化所繪制出的劑量 -效應(yīng)曲線,稱之為細(xì)胞存活曲線[6]。

        U251細(xì)胞接受不同劑量的快中子輻照后,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞,把細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中備用。將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋,以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿中,并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng),使細(xì)胞分散均勻。置37℃ 5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下,靜置培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí),終止培養(yǎng)。棄去上清液,用PBS小心浸洗2次。加入1∶3醋酸/甲醇5 mL,固定15 min。然后去固定液,加適量Giemsa染色液染10~30 min,之后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。將培養(yǎng)皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片,用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆,最后計(jì)算克隆形成率:

        式(1)中,PE為未照射時(shí)形成的集落數(shù)除以接種的單個(gè)細(xì)胞數(shù)。

        2.5 MTT方法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

        MTT比色法,是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。

        U251細(xì)胞接受不同劑量的快中子輻照后,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞,以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度接種于96孔板中。在輻照后的24、48、72 h加入MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h后,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,每孔加150 μL的DMSO,脫色搖床振蕩10 min,使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm(570 nm)波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值,記錄結(jié)果,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

        2.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

        U251細(xì)胞接受不同劑量快中子輻照后24 h,用不含EDTA的胰酶消化收集所有細(xì)胞,按Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluo-resceinisothiocyanate,F(xiàn)ITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)熒光染色試劑盒(北京凱基公司)操作說(shuō)明染色后,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。具體步驟如下:收集所有細(xì)胞后,用PBS洗滌細(xì)胞兩次,收集1至5×105個(gè)細(xì)胞;加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;加入5 μL 的Annexin V-FITC混勻后,加入5 μL的 Propidium Iodide,混勻;室溫、避光。孵育5~15 min,并在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

        3.1 細(xì)胞存活率的劑量效應(yīng)曲線

        U251細(xì)胞在接受不同劑量輻照后,其存活曲線分別見(jiàn)圖1和圖2。

        隨著U251細(xì)胞吸收劑量的增加,存活率急劇下降。存活曲線可模擬為輻射劑量的指數(shù)函數(shù),符合單擊單靶模型。與低LET射線相比,快中子的細(xì)胞生存曲線基本沒(méi)有亞致死性損傷修復(fù)的肩區(qū),而是近似直線。

        圖1 U251細(xì)胞存活曲線Fig.1 U251 cell survival curves

        圖2 U251細(xì)胞存活曲線對(duì)數(shù)圖Fig.2 U251 cell survival curves logarithm figure

        3.2 快中子輻射對(duì)U251細(xì)胞增殖的抑制

        從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的改變(見(jiàn)圖3)可見(jiàn)快中子輻射對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制和殺傷作用。細(xì)胞接受1 Gy,3 Gy劑量照射后48 h內(nèi),并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的增殖抑制。至72 h,快中子對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸體現(xiàn)出來(lái),隨著細(xì)胞吸收劑量的增大,射線對(duì)細(xì)胞的殺傷作用逐漸增強(qiáng),表現(xiàn)為OD值的逐漸下降。但與低劑量(1 Gy和3 Gy)輻照相比,吸收劑量為5 Gy和7 Gy時(shí),細(xì)胞增殖能力的變化并無(wú)顯著性差異。

        3.3 快中子誘發(fā)的U251細(xì)胞凋亡

        圖4為U251細(xì)胞接受3 Gy劑量照射后24 h的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。由圖4可見(jiàn),凋亡細(xì)胞中多數(shù)已進(jìn)入晚期凋亡繼發(fā)壞死的階段(第2象限),有部分細(xì)胞處于早期凋亡階段(第4象限),并有少量壞死細(xì)胞(第1象限)??偟牡蛲黾?xì)胞數(shù)為第2,第4象限細(xì)胞數(shù)目之和。

        圖3 U251細(xì)胞在輻照后72 h內(nèi)的生長(zhǎng)曲線Fig.3 U251 cell growth curve within 72 h after the irradiation

        圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果Fig.4 Cell apoptosis results measured by flow cytometry

        U251細(xì)胞接受不同劑量快中子輻照24 h后(見(jiàn)圖5),隨著細(xì)胞吸收劑量的增大,凋亡率增高,且主要為晚期繼發(fā)壞死階段的凋亡細(xì)胞。

        3.4 討論

        中子本身并不會(huì)引起物質(zhì)電離,但它在生物體內(nèi)會(huì)因核反應(yīng)而引起反沖質(zhì)子或α粒子,這些都是高LET射線,因此中子也屬于高LET射線。高LET的射線對(duì)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)更大。

        3.4.1 RBE 值

        相對(duì)生物效應(yīng)(relative biological effectiveness,RBE)指與250 kV X線相比較,在相等生物效應(yīng)的基礎(chǔ)上,所需的250 kV X線和待測(cè)定的(如中子)射線的劑量之比。對(duì)快中子而言,RBE值不是固定不變的,影響因素很多,主要是隨著分次劑量的降低,RBE值增高。在細(xì)胞存活曲線上,若以單次照射后產(chǎn)生的細(xì)胞存活率0.01為參考點(diǎn),所對(duì)應(yīng)的所需中子劑量為6.6 Gy,X線為10 Gy,則RBE值=10 Gy/6.6 Gy=1.5;同樣的若以細(xì)胞存活率 0.6 為參考點(diǎn),則所需的快中子與X線劑量分別為1 Gy和3 Gy,RBE值為3 Gy/1 Gy=3??熘凶拥募?xì)胞生存曲線基本沒(méi)有低LET射線亞致死性損傷修復(fù)的肩區(qū),而是近似直線。RBE值在肩區(qū)劑量范圍內(nèi)即低劑量區(qū)是最高,分次照射實(shí)際上就是肩區(qū)部分低劑量的重復(fù)照射,故小劑量照射時(shí)的RBE值較單次大劑量照射高。

        圖5 輻照24 h后流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的U251細(xì)胞凋亡率Fig.5 U251 cell apoptosis rate measured by flow cytometry 24 h after irradiation

        高沛永等[7]研究核爆炸瞬時(shí)輻射誘發(fā)人血染色體畸變的劑量效應(yīng)特點(diǎn),并與60Co γ線進(jìn)行比較。結(jié)果表明:中子誘發(fā)畸變的RBE一般大于3,且隨著受照劑量的降低有增高的現(xiàn)象。

        據(jù)現(xiàn)代放射生物學(xué)的觀點(diǎn),按增值的速度和照射后損傷表達(dá)的潛伏期長(zhǎng)短,可把正常組織區(qū)分為早期或急性反應(yīng)組織和后期反應(yīng)組織,它們的RBE也不同。在低LET射線的照射后的細(xì)胞存活曲線中,后期反應(yīng)組織肩區(qū)較早期反應(yīng)組織肩區(qū)更彎曲。雖然RBE值均隨分次劑量降低而增加,但增加的速度在后期反應(yīng)組織中更快,以致形成在高劑量區(qū)其RBE值較早期反應(yīng)低,在低劑量區(qū)域即臨床相關(guān)劑量區(qū)域較早期反應(yīng)組織高[8]。

        3.4.2 對(duì)細(xì)胞輻射敏感性的影響

        在低LET射線照射時(shí),不同的組織和腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性有很大差別,表現(xiàn)在細(xì)胞存活率的斜率不一樣即D0值有較大的差異,但在應(yīng)用快中子等高LET射線治療時(shí),其輻射敏感性差異顯著縮小。

        針對(duì)農(nóng)村初中古詩(shī)詞教育輕視誦讀教學(xué)、照搬參考書(shū)、忽視激發(fā)學(xué)生興趣、教學(xué)手段單一等問(wèn)題,依據(jù)“教師為主導(dǎo)、學(xué)生為主體”的理念,通過(guò)課內(nèi)進(jìn)行情境教學(xué)改革,課外進(jìn)行初中語(yǔ)文古詩(shī)詞讀書(shū)分享學(xué)習(xí)模式探索以及“網(wǎng)絡(luò)多媒體+古詩(shī)詞”的學(xué)習(xí)方式研究,形成“課內(nèi)+課外+網(wǎng)絡(luò)多媒體”三位一體相結(jié)合的教學(xué)模式。提高了學(xué)生對(duì)詩(shī)人情感的理解能力,培養(yǎng)了學(xué)生的古詩(shī)詞鑒賞能力,提高了學(xué)生的人文素養(yǎng)和審美情趣,引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識(shí)中華文化的豐厚博大,吸收民族文化智慧,激發(fā)學(xué)生的想象力和創(chuàng)作潛能,促進(jìn)個(gè)性發(fā)展,豐富精神世界。

        3.4.3 對(duì)腫瘤的OER值的影響

        幾乎所有的惡性腫瘤都是乏氧細(xì)胞,它們對(duì)射線較為抵抗。氧增強(qiáng)比(oxygen enhancement ratio,OER)即是在達(dá)到同樣生物效應(yīng)時(shí),乏氧細(xì)胞和富氧細(xì)胞所需的劑量之比。低LET射線單次照射的OER值在3.0左右??熘凶诱丈鋾r(shí),乏氧細(xì)胞和富氧細(xì)胞的放射敏感性差異減小,OER值降為1.6左右。因而對(duì)腫瘤而言,獲得了3.0∶1.6=1.9 的治療增益。

        與所有高LET射線一樣,快中子射線在體內(nèi)電離作用主要是對(duì) DNA分子鏈的直接作用,引起DNA鏈的斷裂,而低LET射線則以間接作用為主,即通過(guò)對(duì)水的電離產(chǎn)生活躍的自由基,后者與生物大分子結(jié)合,作用于DNA鏈,該過(guò)程必須有氧的存在才能使損傷固定,這也就是低LET射線對(duì)氧的依賴作用遠(yuǎn)大于高LET射線的原因。

        3.4.4 對(duì)亞致死性損傷和潛在致死性損傷修復(fù)的影響

        分次照射中亞致死性損傷和潛在致死性損傷修復(fù)是影響低LET射線照射生物效應(yīng)的重要因素?,F(xiàn)在已經(jīng)證實(shí),LET值的增加會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷修復(fù)能力的減少,這也是為什么每次照射劑量變小時(shí),快中子的RBE值會(huì)逐漸增加的原因之一。根據(jù)上述關(guān)系,可以知道只有在低LET射線照射時(shí),腫瘤組織的修復(fù)能力大于周?chē)=M織的修復(fù)能力時(shí),那么快中子照射會(huì)得到較好的療效。

        另外,當(dāng)快中子照射時(shí),由于損傷修復(fù)明顯減少甚至消失掉,其等效劑量與分次劑量的關(guān)系不像低LET射線那樣密切。換言之,分次劑量的降低不再能有效地保護(hù)后期反應(yīng)組織,而同時(shí),它帶來(lái)另一方面的意義,即適當(dāng)?shù)卦龃蠓执蝿┝?,減少照射次數(shù),縮短療程,得以克服腫瘤干細(xì)胞加速再增殖。這一點(diǎn)對(duì)增殖快的腫瘤尤為重要。

        3.4.5 對(duì)細(xì)胞周期時(shí)相輻射敏感性差異的影響

        低LET照射時(shí),不同細(xì)胞周期的放射敏感性差異很大,最敏感的是G2/M期,最不敏感的是S期后期,通過(guò)細(xì)胞周期的重新分布,使不敏感時(shí)相細(xì)胞有機(jī)會(huì)進(jìn)入敏感時(shí)相而在下一次照射中被殺滅。這已成為分割照射的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。在高LET射線照射時(shí),細(xì)胞周期時(shí)相敏感性差異明顯縮小,但由于細(xì)胞周期再分布及正常組織也存在放射敏感性的差異,因而快中子治療會(huì)帶來(lái)多大的益處尚不清楚。

        因而,從上面的分析中可看到,亞致死性損傷及修復(fù)、乏氧、細(xì)胞周期等影響低LET射線生物效應(yīng)的因素在高LET射線照射時(shí)的作用不那么明顯。在不同的組織之間,快中子產(chǎn)生的是一種較低LET射線簡(jiǎn)單、均一的生物效應(yīng),RBE值的變化是由于低LET照射時(shí)生物效應(yīng)的復(fù)雜性引起的[9]。

        4 結(jié)語(yǔ)

        快中子治癌是核科學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究,是核粒子束流應(yīng)用于腫瘤放射治療的前沿研究重要課題之一。這是涉及到放射物理學(xué)、放射化學(xué)、放射腫瘤學(xué)等學(xué)科交叉的課題。中子屬于高LET射線,具有相對(duì)生物效應(yīng)高、氧增比小、一次劑量打擊殺死癌細(xì)胞較多、癌細(xì)胞積累能力及修復(fù)亞致死性損傷能力小、對(duì)細(xì)胞周期的各階段均起作用、對(duì)大多數(shù)抗輻射類(lèi)型的腫瘤有效等優(yōu)點(diǎn)。

        由快中子誘導(dǎo)的U251細(xì)胞劑量-存活曲線可看出,快中子對(duì)細(xì)胞殺傷較大,存活曲線可模擬為輻射劑量的指數(shù)函數(shù),符合單擊單靶模型,且基本沒(méi)有亞致死性損傷修復(fù)的肩區(qū)。

        有研究表明,U251細(xì)胞的倍增時(shí)間約為18 h。48 h內(nèi),低劑量的快中子輻照對(duì)細(xì)胞的增殖抑制并不明顯,72 h內(nèi)抑制作用顯著,體現(xiàn)出周期阻滯作用。

        細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在病理或生理狀態(tài)下、啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)部的死亡程序而引起的一種主動(dòng)死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。以往的研究表明:γ射線殺死細(xì)胞的一個(gè)途徑是激活細(xì)胞的凋亡機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,快中子同樣可以誘發(fā)U251細(xì)胞的凋亡,且與γ射線相比,凋亡率高,表現(xiàn)出較高的相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)。

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