李 利，李力韜，郭喬楠 (第三軍醫(yī)大學(xué):.學(xué)員旅7隊(duì);.西南醫(yī)院病理學(xué)研究所，重慶 400038)

Nell-1(neural epidermal growth factor-like 1)基因定位于染色體11p15.1-p15.2，是一種新型生長(zhǎng)因子，具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨組織礦化，最終促進(jìn)新骨質(zhì)形成的作用。Nell-1作為潛在的新型成骨基因，有更強(qiáng)的安全性和特異性，可能在骨組織工程中發(fā)揮作用并且有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。此外，也有研究顯示Nell-1基因在大腸癌及Burkitt’s淋巴瘤中有異常表達(dá)?；贜ell-1在成骨細(xì)胞分化和凋亡過程中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，推斷Nell-1的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及抑制成骨細(xì)胞增殖作用在骨肉瘤等骨組織腫瘤中可能扮演抑癌基因角色。

1 Nell-1基因及其編碼蛋白的特點(diǎn)

Nell-1首先由Watanabe等［1］分離自人胎兒腦cDNA，它們編碼包含6個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣區(qū)域，Nell-1基因定位于染色體11p15.1-p15.2，Nell-1 的 cDNA 長(zhǎng)度為2 977 bp，包含編碼810個(gè)氨基酸的開放性閱讀框架(ORF)，大鼠和人的序列具有93%的同源性。

Nell-1基因編碼一個(gè)90 kDa的多肽，其分泌蛋白以三聚體的形式存在(分子量約400 kDa)。Nell-1蛋白包含1個(gè)疏水的N末端信號(hào)肽、1個(gè) NH2端血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)樣模序、1個(gè)卷曲螺旋區(qū)、5個(gè)血管假性血友病因子C結(jié)構(gòu)域和6個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域。TSP-1作用于不同的受體、細(xì)胞因子、蛋白酶及胞外分子(如潛伏狀態(tài)TGFβ1等)，在細(xì)胞的粘附、遷移和增殖過程中起作用。TSP-1能在細(xì)胞外結(jié)合并活化處于潛伏狀態(tài)的TGFβ1，而TGFβ1是破骨細(xì)胞生成及神經(jīng)嵴細(xì)胞分化的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，提示Nell-1也可能在胞外活化TGFβ1超家族成員并產(chǎn)生相似作用。另外，有學(xué)者對(duì)Nell-1蛋白的EGF樣結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示Nell-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)通過EGF結(jié)構(gòu)與蛋白激酶CβⅠ(PKCβⅠ)結(jié)合并被其磷酸化，Nell-1的EGF樣結(jié)構(gòu)域與PKC都對(duì)碘氧基苯甲醚有特異性作用。據(jù)此他們提出Nell-1的EGF樣區(qū)域可能作為PKC調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路的靶點(diǎn)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、腫瘤發(fā)生及凋亡等胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的假設(shè)。

2 Nell-1在成骨方面的調(diào)控作用

2.1 Nell-1促成骨細(xì)胞分化與骨形成

顱縫早閉，是人類常見的先天顱面畸形的一種，發(fā)病率為1/2 500～1/3 000個(gè)嬰兒。Watanabe等［1］最早于人腦和腎臟組織中檢測(cè)到Nell-1極其微弱的表達(dá)，后發(fā)現(xiàn)Nell-1在顱面部骨組織中優(yōu)先表達(dá)，并且在顱縫早閉(CS)患者的顱縫周圍組織中發(fā)現(xiàn)Nell-1過度表達(dá)。有研究證實(shí)Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠過早關(guān)閉的顱縫中有多種骨性聯(lián)結(jié)表型，且Nell-1在成骨細(xì)胞中過表達(dá)明顯促進(jìn)了堿性磷酸酶和微結(jié)節(jié)形成，進(jìn)而促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化和礦化，而當(dāng)Nell-1表達(dá)下調(diào)時(shí)體外成骨細(xì)胞的分化受到抑制。這些均提示Nell-1可能在顱縫閉合過程中扮演局部調(diào)節(jié)因子的作用。還有研究在Nell-1缺乏的小鼠模型中觀察到長(zhǎng)骨及椎體的成骨缺陷，提示Nell-1在脊柱及外周骨的成骨過程中也發(fā)揮著成骨作用。此外，Nell-1還可通過體外作用于多種細(xì)胞，促進(jìn)大型或小型哺乳動(dòng)物骨的形成［2-4］。

Desai等［5］利用N-乙烷-N-亞硝基脲誘導(dǎo)新生小鼠 Nell-1基因點(diǎn)突變獲得Nell-1(6R)突變小鼠，Nell-1(6R)基因含有一個(gè)T-A堿基替換使編碼半胱氨酸的密碼子轉(zhuǎn)換成一個(gè)過早的終止密碼子［Cys(502)Ter］，使大部分基因編碼的具有促進(jìn)成骨、成軟骨細(xì)胞間的黏附和細(xì)胞間通訊以及維持組織結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和彈性的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，如特異型膠原、凝血酶敏感蛋白和腱蛋白等明顯下降，最終導(dǎo)致小鼠的軟骨異常、脊柱彎曲度異常、胸廓異常和頭顱形態(tài)異常。說明Nell-1基因具有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨組織礦化，最終促進(jìn)新骨質(zhì)形成的作用。如果Nell-1基因的表達(dá)降低，成骨作用亦會(huì)受到抑制。

胡鏡宙等［6］國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)Nell-1基因在體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化做了研究，他們利用腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠脛骨和股骨骨髓后分未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，LacZ)基因的LacZ組以及轉(zhuǎn)染Nell-1基因的Nell-1組三個(gè)組。他們選用ALP作為BMSCs向成骨細(xì)胞分化的一個(gè)重要指標(biāo)，結(jié)果顯示Nell-1組的ALP含量明顯高于另外兩組，證實(shí)了轉(zhuǎn)染Nell-1基因組可以提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP活性。另外，因骨C-羧基谷氨酸蛋白(bone C-glutamicacid-containing protein，BGP/OC)是一個(gè)高度特異性的成骨分化蛋白，其表達(dá)呈現(xiàn)發(fā)育階段特異性，在細(xì)胞結(jié)節(jié)形成時(shí)開始表達(dá)，基質(zhì)礦化時(shí)達(dá)到最高水平，他們將OC作為評(píng)估成骨細(xì)胞外基質(zhì)礦化的指標(biāo)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Nell-1基因組OC的表達(dá)和鈣結(jié)節(jié)形成均明顯高于另外兩組，證實(shí)了Nell-1基因有促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的特性?？傊琋ell-1基因具有促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化進(jìn)而推進(jìn)骨形成的作用。

2.2 Nell-1促成骨細(xì)胞凋亡與骨形成關(guān)系

2.2.1 Fas/Fas-L路徑與Nell-1促成骨細(xì)胞凋亡關(guān)系 有研究提到Fas途徑在正常成骨細(xì)胞凋亡中起重要作用，在S252W FGFR2 Apert顱縫早閉和尖頭并指畸形綜合征Ⅲ型TWIST單倍不足中Tnf和Fas途徑參與了成骨細(xì)胞的凋亡。有報(bào)道稱Nell-1是通過PKC路徑發(fā)出信號(hào)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡，而激活的PKC會(huì)誘導(dǎo) Fas-L基因的轉(zhuǎn)錄［7］。Zhang等［8］觀察了出生12.5 d和15.5 d的Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠的顱蓋、膨出的腦組織及軟顱骨中有Fas和/或Fas-L的上調(diào)，由此證實(shí)了Fas調(diào)節(jié)的路徑是顱蓋成骨細(xì)胞和腦組織的一個(gè)主要的凋亡路徑。在這條路徑中，F(xiàn)as-L激活了Fas受體從而啟動(dòng)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，包括Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)、受體干擾蛋白(RIP)或Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(DAXX)并最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。成骨細(xì)胞的凋亡在分化晚期開始增加，隨后在礦化階段明顯增加，這說明Nell-1基因通過Fas/Fas-L路徑只針對(duì)處于合適條件下的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡且在成骨細(xì)胞分化的不同階段可能扮演著不同的角色。此外，有數(shù)據(jù)顯示當(dāng)Nell-1表達(dá)適度上調(diào)時(shí)會(huì)加速成骨細(xì)胞分化以及顱縫早閉，而大量的Nell-1的過表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)凋亡增加以及神經(jīng)管缺陷，如無(wú)顱蓋。說明Nell-1過表達(dá)在顱骨發(fā)育過程中誘導(dǎo)了中樞神經(jīng)細(xì)胞的異常調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致了顱面發(fā)育的畸形或神經(jīng)管缺陷，而這些也許是由于凋亡增加使得礦化減少、細(xì)胞遷移受到破壞?？傊現(xiàn)as/Fas-L參與Nell-1誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡為神經(jīng)管缺陷的發(fā)生機(jī)制以及人類的顱面異常提供了一種新的思路。

2.2.2 APR3 與 Nell-1 促成骨細(xì)胞凋亡關(guān)系 Zou 等［9］利用Nell-1作為誘餌篩選出凋亡相關(guān)蛋白3(APR3)作為Nell-1結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。APR3首先在全反式維甲酸(ATRA)治療的HL-60細(xì)胞中成功克隆，是一種抑制增殖的膜蛋白，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡。APR3過表達(dá)會(huì)阻斷G1/S期使得細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)啟動(dòng)子活性顯著降低，減少Cyclin D1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。他們通過共聚焦顯微鏡首次發(fā)現(xiàn)了APR3在人類骨肉瘤細(xì)胞株Saos2和U2OS細(xì)胞以及在非腫瘤細(xì)胞株COS-7和293T細(xì)胞中分布在核膜上并通過免疫沉淀反應(yīng)證實(shí)了APR3與Nell-1共同分布在核膜上且直接與Nell-1蛋白結(jié)合。這些成為APR3結(jié)合NELL-1作為促進(jìn)成骨細(xì)胞分化同時(shí)抑制細(xì)胞增殖的一個(gè)潛在的機(jī)制。

2.3 Nell-1對(duì)成骨細(xì)胞成骨的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制

2.3.1 Nell-1 與轉(zhuǎn)錄因子 Runx2/Cbfa1 關(guān)系 Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2/Cbfa1)對(duì)于成骨是必不可少的。Runx2促進(jìn)下游成骨細(xì)胞基因如a1型膠原(Col1-a1)、骨唾液蛋白(Bsp)，骨橋蛋白(Op)和骨鈣素(Ocn)等基因的轉(zhuǎn)錄是通過結(jié)合到他們的啟動(dòng)子區(qū)域的成骨細(xì)胞特異性結(jié)合元素2(OSE2)。Truong等［10］研究發(fā)現(xiàn)在Nell-1基因的5＇側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游2.2 kb內(nèi)767、972和1 600 bp位置上共識(shí)別3個(gè)成骨細(xì)胞特異性結(jié)合元件2(OSE2)位點(diǎn)，Runx2基因通過與這3個(gè)OSE2結(jié)合激活了人Nell-1基因啟動(dòng)子使得Nell-1基因表達(dá)上調(diào)。然而，將這3個(gè)OSE2位點(diǎn)分布被突變并隨表達(dá)Runx2的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到骨肉瘤Sao2細(xì)胞中。Sao2細(xì)胞的核提取物同3個(gè)位點(diǎn)探針結(jié)合成復(fù)合物后，Nell-1啟動(dòng)子的活性卻顯著降低了，說明Runx2基因在成骨細(xì)胞分化過程中起著總開關(guān)的作用。這些結(jié)果表明Nell-1可能是Runx2的一個(gè)下游調(diào)控靶點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化為骨祖細(xì)胞需要Runx2的激活，Zhang等［11］將Nell-1(CMV-Nell-1)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠與單倍體不足的Runx2(Runx2+/-)小鼠雜交配種后治愈了后者的部分顱蓋缺損，即Nell-1蛋白在Runx2+/-顱蓋移植體中誘導(dǎo)了礦化和骨形成，然而在Runx2-/-卻沒有出現(xiàn)此現(xiàn)象，推測(cè)Nell-1不僅是Runx2的一個(gè)下游靶點(diǎn)，也可能與Runx2在成骨方面具有協(xié)同作用。

2.3.2 Nell-1與促絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的關(guān)系 周海華等［12］曾探討了促絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路在Nell-1介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化中的作用。JNK激酶通路參與成骨細(xì)胞分化增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且在應(yīng)急、程序性細(xì)胞死亡、骨質(zhì)代謝和炎癥中發(fā)揮重要作用。ECM蛋白能夠與TSP-1等相互作用間接激活Ras-MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，再通過Runx2蛋白實(shí)現(xiàn)向成骨細(xì)胞的分化。他們根據(jù)人Nell-1與TSP-1結(jié)構(gòu)域的相似性推斷Nell-1也可能通過該路徑調(diào)控成骨細(xì)胞的分化。

3 Nell-1應(yīng)用于骨組織工程研究進(jìn)展

在正常情況下，成骨細(xì)胞主要是合成和向細(xì)胞外分泌各種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，促進(jìn)這些ECM沉積并最終形成致密的骨組織結(jié)構(gòu)。骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)作為骨移植替代物是目前應(yīng)用最廣泛的成骨生長(zhǎng)因子，但BMP-2在骨誘導(dǎo)方面存在多種副作用如促脂肪形成［13］、腫瘤形成等。另外，多數(shù)顱面缺損目前需采取骨移植或外科修補(bǔ)方法，自體骨移植作為治療顱面缺損的常用手段，存在手術(shù)致畸和自體骨有限等問題。因此，隨著骨組織工程技術(shù)的逐漸成熟，開發(fā)劑量可控性、對(duì)機(jī)體的副作用小以及臨床可操作性強(qiáng)的新型促進(jìn)骨形成的生長(zhǎng)因子成為研究的熱點(diǎn)。Aghaloo等［14］將 Nell-1蛋白植入鼠顱蓋缺損部位顯示Nell-1誘導(dǎo)骨再生的能力與BMP-2相當(dāng)，而Nell-1促進(jìn)細(xì)胞的礦化只針對(duì)具有成骨潛能的細(xì)胞，說明Nell-1相比BMPs的成骨作用方面在安全性和組織特異性方面更勝一籌。前面提到的Nell-1基因能誘導(dǎo)BMSC向成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)骨形成，使得Nell-1具備了成為骨組織工程生長(zhǎng)因子的基本條件。此外，骨組織工程生長(zhǎng)因子的研究趨向于多生長(zhǎng)因子的聯(lián)合應(yīng)用，有報(bào)道稱Nell-1和BMP-2基因聯(lián)合應(yīng)用于骨組織工程，可以更好地促進(jìn)組織工程骨的形成［15］。骨延長(zhǎng)術(shù)(DO)被公認(rèn)為一種延長(zhǎng)骨的有效技術(shù)，但治療周期長(zhǎng)、結(jié)合纖維或骨折不愈合限制了它的臨床應(yīng)用。Zhu等［16］將48只兔子的單側(cè)脛骨延長(zhǎng)7天后隨機(jī)分為4組，分別在延長(zhǎng)端給予標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖液、50μg rhNell-1、50μg rhBMP-2、25μg rhBMP-2 和 25μg rhNell-1，結(jié)果顯示重組人骨形成蛋白2(rhBMP-2)與NELL-1分子聯(lián)合治療組的骨密度、骨礦含量、骨小梁厚度最高且骨小梁間隔最小，證實(shí)BMP-2和Nell-1聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)了彼此的功效，從而明顯地促進(jìn)了骨愈合，同時(shí)Nell-1能夠減少BMP作為成骨生長(zhǎng)因子相關(guān)的副作用［2］，Aaron等［13］通過研究認(rèn)為 Nell-1可以逆轉(zhuǎn)大劑量BMP-2的促脂肪形成的作用。總之，Nell-1與BMP-2聯(lián)合治療能夠產(chǎn)生組織修復(fù)量增加、更好的組織特性及促進(jìn)愈合的效果，二者聯(lián)合應(yīng)用可能縮短治療周期和促進(jìn)骨延長(zhǎng)術(shù)后療效，特別是針對(duì)那些因?yàn)槟挲g增長(zhǎng)、骨質(zhì)疏松癥和腫瘤輻照后成骨能力下降的患者，為骨組織工程臨床治療提供了一個(gè)更好的思路。

除了Nell-1的成骨作用及對(duì)抗BMP-2相關(guān)副作用外，若要應(yīng)用于臨床治療，還需要具備合適的載體和劑量可控性。目前利用軟骨生長(zhǎng)因子促進(jìn)軟骨修復(fù)和軟骨再生的軟骨組織工程是整形和外科重建多用的方法。Nell-1是一種新型生長(zhǎng)因子被認(rèn)為具有軟骨細(xì)胞系靶細(xì)胞特異性。Lee等［17］將兔軟骨細(xì)胞置于三維立體藻酸鹽水凝膠微環(huán)境中培養(yǎng)，采用殼聚糖:TPP︰CHS按5︰1︰1的比例將Nell-1包被在殼聚糖微粒中持續(xù)釋放Nell-1，結(jié)果顯示包被了Nell-1的治療組軟骨細(xì)胞增殖和集落的形成明顯增多且含有更多的II型膠原和粘多糖。說明Nell-1具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)軟骨特異性沉積的功能。通過封裝或吸附到釋放系統(tǒng)來釋放DNA、多肽和蛋白質(zhì)等分子已被廣泛應(yīng)用。DBX是一個(gè)商業(yè)上用于骨移植的脫鈣骨基質(zhì)(DBM)和透明質(zhì)酸鈉(作為DBX載體)的混合物。b-TCP，因其生物相容性和骨傳導(dǎo)性通常被作為臨床骨替代物的材料，目前已被廣泛用作局部傳遞BMP-2的載體，在體內(nèi)b-TCP與透明質(zhì)酸或膠原蛋白相比具有相對(duì)較慢的(4～6周)吸收速度，這樣延長(zhǎng)了蛋白質(zhì)傳遞時(shí)間使蛋白質(zhì)充分發(fā)揮生物效應(yīng)。Li等［18］將Nell-1蛋白加載到大小為200～300 mm b-TCP微粒上，并將其與DBX混合，結(jié)果顯示植入了2.5 mg或5.0 mg含有Nell-1載體的動(dòng)物超過75%在術(shù)后4周擁有了堅(jiān)固的脊柱融合。相比之下，植入不含Nell載體的動(dòng)物有75%融合失敗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明Nell-1這個(gè)新型的生長(zhǎng)因子被凍干加入到b-TCP微粒并與DBX混合后顯著提高了大鼠的脊柱融合率。在安全的前提下，這種材料可能作為傳遞Nell-1蛋白質(zhì)的骨移植材料應(yīng)用于臨床的脊椎融合和其他骨組織工程中，從而提高人類脊柱融合率和病人生活質(zhì)量。

4 Nell-1與疾病的關(guān)系及展望

有人發(fā)現(xiàn)Nell-1在人類所有正常造血細(xì)胞中檢測(cè)不到成熟的Nell-1 mRNA，而唯一的在前B細(xì)胞發(fā)育過程中的一定階段可檢測(cè)到未成熟的、未經(jīng)剪切的Nell-1 mRNA。為部分前B細(xì)胞白血病提供一種可能的診斷標(biāo)記。啟動(dòng)子的超甲基化所引發(fā)的基因沉默是癌發(fā)生機(jī)制中的一個(gè)中心事件。Mori等［19］發(fā)現(xiàn)Nell-1在結(jié)腸癌中作為新的啟動(dòng)子甲基化位點(diǎn)之一，可能扮演潛在的腫瘤抑制基因角色。近年來，研究基因異常與骨腫瘤的發(fā)生及癌細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系已是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一，原癌基因激活和抑癌基因失活是部分腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。骨肉瘤是原發(fā)性骨腫瘤中最常見的惡性腫瘤。由于Nell-1對(duì)成骨細(xì)胞的分化、凋亡有促進(jìn)作用，并且抑制成骨細(xì)胞增殖，提示Nell-1可能在骨肉瘤等骨組織腫瘤中扮演抑癌基因的角色。所以，觀察Nell-1基因在骨肉瘤組織以及瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，闡明Nell-1的抑癌作用并進(jìn)一步探索其作用機(jī)制將是一項(xiàng)有意義的研究。

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