梁宋平

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長沙410081）

動物毒器是動物在億萬年進化過程中為生存(捕食和防衛(wèi))而形成的高度特化器官，其產(chǎn)生的毒液中含有豐富多樣的專一性作用于各種動物膜通道及受體的多肽毒素。與其它生物活性物質(zhì)相比，動物多肽毒素具有以下3個顯著的特點：1)自然界億萬年的進化選擇賦予動物多肽毒素具有高活力(作用通道和受體活性達到皮摩爾水平)和強專一性(有效區(qū)分膜通道和受體亞型)；2)在協(xié)同進化驅(qū)使下，動物多肽毒素廣泛存在多拷貝基因家族和高進化速率，從而呈現(xiàn)驚人的分子水平生物多樣性；3)差異的生態(tài)環(huán)境使不同地域的動物毒素具有功能和結(jié)構(gòu)的特殊性。我國有豐富多樣的有毒物種資源，迄今為止已發(fā)現(xiàn)芋螺百余種，蝎類30余種，蛇類200余種，兩棲類400余種，蜘蛛有4000多種，昆蟲數(shù)萬種以及數(shù)量眾多的其他有毒動物。在地域廣闊和生態(tài)復(fù)雜的我國，動物多肽毒素的上述特點使它們早已成為國際競爭挖掘和利用的天然藥物資源。近年來，新型動物多肽毒素的挖掘與利用在國際生命醫(yī)學(xué)研究和創(chuàng)新藥物開發(fā)中更為活躍。它們已成為解析生命現(xiàn)象必備的"分子探針與解密器"，推動了生命科學(xué)領(lǐng)域中最具有挑戰(zhàn)性的諸如醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)等學(xué)科的蓬勃發(fā)展，成為新藥作用靶點發(fā)現(xiàn)與確立的有力工具以及新藥創(chuàng)制的優(yōu)質(zhì)先導(dǎo)分子。本文就動物多肽毒素研究的科學(xué)意義以及國內(nèi)外該領(lǐng)域當(dāng)前的研究熱點作一簡要綜述。

1 開展動物多肽毒素研究的科學(xué)意義和應(yīng)用價值

1.1 動物多肽毒素是解析膜通道及受體的結(jié)構(gòu)與功能的分子探針

膜通道及受體的結(jié)構(gòu)-功能研究是揭開人類疾病奧秘的關(guān)鍵，倍受科學(xué)界的關(guān)注。1952年，Alan Hodgkin等(1963年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎得主)證明了細胞膜上通道的存在，并記錄到了膜通道貢獻的動作電位信號；Jens Skou(1997年諾貝爾化學(xué)獎得主)發(fā)現(xiàn)了一類能從低濃度向高濃度跨細胞膜轉(zhuǎn)運物質(zhì)細胞膜鈉-鉀泵；Erwin Neher(1991年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎得主)發(fā)明了膜片鉗技術(shù)，解決了細胞膜電流的測定問題；MacKinnon等在前人研究成果的基礎(chǔ)之上首次成功地測定了一種鉀通道膜蛋白的空間結(jié)構(gòu)，驗證了鉀通道的組裝、結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的共性問題[1]，因此摘得了2003年的諾貝爾化學(xué)獎。然而，膜通道的結(jié)構(gòu)組裝、生物活性物質(zhì)跨膜運動、膜通道門控信息的整合調(diào)控等一系列重大基礎(chǔ)問題仍未解決。

動物多肽毒素作為研究這一重要基礎(chǔ)科學(xué)問題的"生物分子探針或鑰匙"，對揭示膜通道及受體蛋白的結(jié)構(gòu)特征、功能機制等研究做出了極其重要、不可替代的貢獻。例如，蜘蛛毒素Hanatoxin－I作為電壓門控鉀通道的調(diào)制劑，對于揭示Kv2.1鉀通道電壓敏感元件的構(gòu)象及門控調(diào)節(jié)機制起到非常重要的作用，已成為研究鉀通道必不可少的工具分子[2,3]。類似的范例還有 -銀環(huán)蛇毒素與膽堿能受體、長鏈 -蝎多肽毒素與電壓門控鈉通道、非洲曼巴蛇Dendrotoxin與Kv1.1鉀通道、蜂毒明肽與小電導(dǎo)鈣激活鉀通道 (SKCa)、芋螺毒素ω－GVIA和MVIIA與N－型電壓門控鈣通道等等。這些成果推動著醫(yī)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)等眾多現(xiàn)代生命科學(xué)不斷發(fā)展、知識不斷更新

1.2 動物多肽毒素是探究某些重大疾病發(fā)病機制的分子工具

動物多肽毒素也是探究重大疾病發(fā)病機制的重要分子工具。如蝎毒液中Chlorotoxin多肽毒素可特異性結(jié)合腫瘤組織，它通過與金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2和細胞膜上氯通道發(fā)生復(fù)雜的相互作用，有效地抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞上的氯電流[4]。由于Chlorotoxin多肽毒素具有特異性結(jié)合腫瘤組織的特性，其作為分子探針在腫瘤疾病發(fā)生機制方面的研究十分活躍[5,6]。又比如，離子通道與痛覺的傳遞有著復(fù)雜的關(guān)系，以前人們并不清楚N-型鈣離子通道與疼痛相關(guān)，正是由于發(fā)現(xiàn)芋螺毒素Conotoxin-MVIIA，一種N-型鈣離子通道的抑制劑，具有很好的鎮(zhèn)痛效果，從而明確了神經(jīng)突觸前膜的N-型鈣離子通道是與疼痛相關(guān)的重要離子通道。

當(dāng)前，動物多肽毒素與膜通道及受體相互作用，導(dǎo)致膜通道蛋白分子器件的結(jié)構(gòu)動態(tài)變化又成了一個全新的研究熱點[7]。不同有毒動物分泌的不同多肽毒素作用于多樣的膜通道及受體(如鈉、鉀、鈣、氯、TRP等膜通道)，機制極其復(fù)雜，即使選擇性地作用于同一類膜通道，其調(diào)制機理也可能是多樣的[8]。動物多肽毒素與相關(guān)膜通道及受體的關(guān)系，猶如"矛與盾"，相互統(tǒng)一，相互依賴，相互適應(yīng)。解析其中奧秘恰是當(dāng)今全球相關(guān)科學(xué)家們實施全新藥物戰(zhàn)略目標(biāo)的關(guān)注焦點。。

1.3 動物多肽毒素是創(chuàng)新藥物的源泉

我國傳統(tǒng)醫(yī)藥常用"以毒攻毒"的策略治療人類的疑難雜癥，有毒動物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等是首選。當(dāng)今，靶特異性動物多肽毒素已成為全球化研發(fā)/治療相關(guān)疾病重要藥物的資源[9]。例如，來源于蜥蜴毒素的 Exenatide,特異作用于GLP-1受體，已于2005年4月被美國FDA批準(zhǔn)用于II型糖尿病治療；具有鎮(zhèn)痛作用的ω-芋螺毒素Ziconotide，為N-型電壓門控鈣通道阻滯劑，于2004年12月28日被美國FDA正式批準(zhǔn)為鞘內(nèi)注射治療疼痛的新藥(商品名為Prialt)。目前臨床上多種廣泛應(yīng)用的多肽類心血管藥物也來源于動物多肽毒素，如臨床上首個成功的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑captopril，是從毒素舒緩激肽增強肽結(jié)構(gòu)發(fā)展而來的；美國默克公司于1998年向市場推出了以非洲曼巴蛇毒素為分子模板研"Agrastant"新藥，可使心絞痛發(fā)生率減少三分之一；目前正開展臨床II期實驗的蜘蛛多肽毒素GsMTx4，專一性抑制機械門控陽離子通道，極有可能成為治療心律失常最好藥物[10]；從葉蛙屬(Phyllomedusa)皮膚中獲得的有麻醉作用的蛙啡肽，鎮(zhèn)痛作用是嗎啡的2000倍,且無藥物耐受性和成癮性，已進入三期臨床實驗。我國在動物多肽毒素藥物研發(fā)中也取得了許多重要的成果。中科院昆明動物所研究人員以眼鏡蛇多肽神經(jīng)毒cobra toxin研制的用于鎮(zhèn)痛的國家新藥"克洛曲"已廣泛用于臨床，該藥具有鎮(zhèn)痛效果強，藥效時間長，成癮性小的特點。湖南師范大學(xué)與北京大學(xué)未名生物工程公司合作研究的N-型鈣通道抑制劑HWAP-I作為具有很強鎮(zhèn)痛作用的國家一類新藥，已完成臨床前研究，獲得進入臨床試驗批文。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院從芋螺中發(fā)現(xiàn)的專一作用于N型 鈣通道抑制劑SO-3，鎮(zhèn)痛活性高于臨床藥物MVIIA，目前即將完成臨床前試驗。上海大學(xué)相關(guān)實驗室針對東亞鉗蝎多肽毒素的系統(tǒng)動物疼痛或鎮(zhèn)痛行為學(xué)模型研究，表明我國蝎毒中含有多種致痛/鎮(zhèn)痛或癲癇/抗癲癇的膜鈉或鉀通道型活性成份。上海大學(xué)和美國洛杉磯錫達－西奈醫(yī)學(xué)中心最近發(fā)現(xiàn)蝎多肽毒素可有效地抑制腫瘤的生長[11,12]。此外，上海大學(xué)發(fā)現(xiàn)的專利多肽產(chǎn)品martentoxin、美國加利福利亞大學(xué)在研的海葵多肽毒素ShK、法國國家科學(xué)研究中心研究的蝎毒素OSK1多肽有望成為阻斷鉀通道(BKCa、Kv1.3和IKCa)的新型多肽藥物[13,14]?？梢姡沁@些多肽毒素特異作用于膜通道及受體，才具有良好的應(yīng)用效果和廣闊的臨床應(yīng)用前景。

近期完成的人類基因組計劃資料顯示，編碼膜通道分子器件基因約有350個。由于這些膜通道擔(dān)負著重要的生理功能如神經(jīng)和肌肉興奮性的調(diào)節(jié)、激素分泌、細胞增殖、感覺信號傳導(dǎo)、學(xué)習(xí)和記憶、血壓調(diào)節(jié)、受精和細胞死亡等，因此，通道的基因缺失、突變或功能性失調(diào)會導(dǎo)致一系列疾病發(fā)生，如高血壓、糖尿病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[15,16]。世界衛(wèi)生組織于2007年3月27日公布全世界約有10億人口受膜通道相關(guān)神經(jīng)障礙的折磨，造成巨大損失。由于膜通道的變化與人類疾病密切相關(guān)，因此，隨著研究的不斷深入，全球高度關(guān)注約350個膜通道亞型在生理和病理中的作用，使人類對膜通道相關(guān)疾病的病因、預(yù)防和治療有了新的認識。例如，鉀通道hERG已成為篩選可能引起長QT綜合癥副作用的關(guān)鍵膜通道靶標(biāo)[17]，這一重大成果直接發(fā)現(xiàn)了臨床上廣為使用藥物，如MK-499,cisapride,terfenadine等，不但不能治療疾病，而是導(dǎo)致病人死亡的"殺手"，這些藥物已被禁用。另外，鉀通道Kv1.3已成為新型免疫抑制調(diào)制劑的靶標(biāo)蛋白[18,19]，藥用前景十分可觀。因此，隨著越來越多的膜通道被鑒定為多肽毒素新藥的靶標(biāo)蛋白，充分認識和挖掘我國動物多肽毒素資源，系統(tǒng)深入地開展疾病相關(guān)膜通道靶向多肽毒素新藥研究，意義重大。

2 當(dāng)前動物多肽毒素的的研究熱點

2.1 動物多肽毒素分子多樣性與結(jié)構(gòu)特征

為挖掘和認識自然界的動物多肽毒素資源，國內(nèi)外眾多實驗室都開展了多肽毒素的生化分離和基因克隆篩選。法國國家科學(xué)研究中心率先在世界上開展蝎多肽毒素庫的構(gòu)建工作，并將動物多肽毒素商品化(http://www.latoxan.com/)。以色列也成立了相應(yīng)的動物多肽毒素-膜通道阻斷劑和激動劑的專營公司(http://www.alomone.com/)。墨西哥的學(xué)者在全球范圍內(nèi)搜集有毒動物，并利用直接分離純化-質(zhì)譜法和構(gòu)建基因庫方法，大規(guī)模地開展動物多肽毒素庫的工作[20]。

我國是世界上有毒動物資源最豐富的國家之一，國內(nèi)科研人員在國家有限資金投入下，努力地開展了蜘蛛、蝎、蛙、芋螺、蜂等有毒物種毒腺c-DNA文庫與多肽毒素分子多樣性的研究，縮短了與國外水平的差距。湖南師范大學(xué)研究人員對我國海南捕鳥蛛和虎紋捕鳥蛛的毒液多肽組學(xué)進行了研究，建立了目前單一蜘蛛物種多肽序列最多的數(shù)據(jù)庫，取得國際領(lǐng)先的研究成果[21,22]；上海大學(xué)相關(guān)實驗室研究并原創(chuàng)性命名了我國東亞鉗蝎長鏈神經(jīng)多肽毒素，即電壓門控鈉通道調(diào)制劑達10余個[23,24]；武漢大學(xué)相關(guān)研究組從我國東亞鉗蝎中除發(fā)現(xiàn)了約80個膜通道亞型調(diào)制劑外，還首次發(fā)現(xiàn)了一類新的無二硫鍵的蝎毒素基因家族[25,26]和一類新的短鏈鉀通道蝎毒素基因亞家族α-KTx14；中科院昆明動物所研究人員通過對牛虻多肽組學(xué)的研究，首次揭示該昆蟲吸血過程抗凝血的分子機制，得到國際同行高度評價[27]。

與此同時，我國相關(guān)研究單位在挖掘動物多肽毒素(同一物種間和不同物種間)的海量信息中蘊藏的自然奧秘方面,也取得了世界領(lǐng)先的很好的研究成果。武漢大學(xué)在國際上首次提出以RNA監(jiān)視和反式剪接為基礎(chǔ)的蝎多肽毒素基因表達調(diào)控機制方面的新假說[28]。

2.2 動物多肽毒素與通道及受體的選擇性及其相互作用機制

有毒動物針對其獵殺對象經(jīng)過億萬年協(xié)同進化產(chǎn)生多種多樣選擇性不同的多肽毒素，以作用于獵物神經(jīng)系統(tǒng)及其他生理系統(tǒng)細胞膜上各種通道和受體蛋白繼而導(dǎo)致獵物麻痹或致死。針對動物多肽毒素-膜通道及受體相互作用的選擇性及其分子機制，我國相關(guān)科研人員在以下4個方面取得重要的研究成果，并將在已有的研究基礎(chǔ)上開展深入研究：(1)動物多肽毒素藥理學(xué)活性的規(guī)模化鑒定：(2)動物多肽毒素的通道調(diào)制機理研究：(3)動物多肽毒素-膜通道及受體相互作用結(jié)構(gòu)信息學(xué)研究；(4)動物多肽毒素作用的新型靶蛋白及其信號通路：

2.3 動物多肽毒素的應(yīng)用開發(fā)研究

高選擇性的動物多肽毒素不僅可成為膜通道及受體鑒定的"多肽毒素探針"，而且是治療相關(guān)的疾病的潛在藥物[29]。現(xiàn)約40余個動物多肽毒素已商品化，且國際市場價格極其昂貴。至少10個動物多肽毒素已被研發(fā)成新藥，廣泛的應(yīng)用于臨床。超過30種動物多肽毒素處于臨床前或臨床試驗階段。雖然我國動物多肽毒素相關(guān)應(yīng)用研究起步較晚，但發(fā)展勢頭強勁。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院從芋螺中發(fā)現(xiàn)的專一作用于N型 鈣通道抑制劑SO-3，鎮(zhèn)痛活性高于臨床藥物MVIIA，目前即將完成臨床前試驗。上海大學(xué)相關(guān)課題組系統(tǒng)地研究了我國多肽毒素鈉通道調(diào)制劑對傷害性感受與癲癇發(fā)作的整體與離體調(diào)制作用及其細胞與分子機制，發(fā)現(xiàn)它們可選擇性調(diào)控初級感覺神經(jīng)元上不同亞型的鈉通道，改變神經(jīng)元興奮性，影響炎癥過程的中樞敏化環(huán)節(jié)，進而在整體行為學(xué)上表現(xiàn)出致/抗傷害性作用或致/抗癲癇發(fā)作[30,31]；武漢大學(xué)也證明我國鈉通道多肽毒素BmKIM對抗大鼠心律失常和癲癇有一定的調(diào)制作用[32]，已獲批了兩項專利。由科學(xué)院昆明動物研究所為主研發(fā)的一類新藥"注射用尖吻蝮蛇凝血酶"獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進入III期臨床研究，該藥與瑞典進口的止血藥"立止血"比較，其有效劑量范圍更寬，使用更安全可靠。昆明動物研究所從兩棲類與昆蟲毒腺中分離到環(huán)狀小肽BA、牛虻免疫調(diào)節(jié)肽和胰島素分泌促進肽等活性多肽，具有較好的研發(fā)抗炎和治療II型糖尿病藥物的前景，現(xiàn)正開展臨床前試驗。湖南師范大學(xué)研究組從我國虎紋捕鳥蛛毒素中分離鑒定出有很強鎮(zhèn)痛活性的虎紋鎮(zhèn)痛肽HWAP-I，獲得了其結(jié)構(gòu)和應(yīng)用國內(nèi)與國際專利?，F(xiàn)已與北大未名集團合作完成了臨床前實驗，并獲得了進入臨床試驗批件。中科院昆明動物所研究人員以眼鏡蛇多肽神經(jīng)毒cobra toxin研制的主要用于鎮(zhèn)痛的國家三類新藥"克洛曲"獲國家新藥證書并投入生產(chǎn)，該藥的特點在于鎮(zhèn)痛效果強，藥效時間長，成癮性?。辉撍幰褟V泛用于臨床，年產(chǎn)值超過億元。

總之，動物多肽毒素在基礎(chǔ)科學(xué)研究、新型生物產(chǎn)業(yè)、創(chuàng)新藥物研發(fā)中具有獨特和不可替代的作用。充分挖掘、保護、認識和利用我國特有動物多肽毒素自然資源，利用動物多肽毒素解析膜通道及受體結(jié)構(gòu)－功能，探究人類重大疾病發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)藥物作用新靶點，研制創(chuàng)新藥物，有著重要科學(xué)意義和應(yīng)用前景。

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