樊 萍，張人明，賀武明，肖蓮蓉，任國(guó)譜

（湖南亞華乳業(yè)有限公司，湖南長(zhǎng)沙410200）

指紋圖譜技術(shù)在乳制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用

樊 萍，張人明，賀武明，肖蓮蓉，任國(guó)譜*

（湖南亞華乳業(yè)有限公司，湖南長(zhǎng)沙410200）

指紋圖譜技術(shù)是一種分析復(fù)雜組分或成品的有效、全面的分析方法。簡(jiǎn)要地介紹了指紋圖譜技術(shù)的特點(diǎn)、研究方法以及指紋圖譜的構(gòu)建。重點(diǎn)概述了指紋圖譜技術(shù)在乳制品領(lǐng)域中的應(yīng)用，包括特征鑒定、摻假識(shí)別、質(zhì)量過(guò)程控制以及微生物監(jiān)測(cè)四個(gè)方面。指紋圖譜技術(shù)將成為乳制品質(zhì)量控制新的發(fā)展方向。

乳制品，指紋圖譜，質(zhì)量控制，應(yīng)用

Abstract：The technology of fingerprint is an effective means to analyze the complex components and products.The characteristics，the research methods and the construction theory of the fingerprint technology were introduced briefly.Application of fingerprint technology in dairy production was discussed emphatically，including flavor characterization，adulteration identification，and quality control of processing and monitoring of microbiology.Fingerprint Technology will be a new development for dairy production quality control.

Key words：dairy production；fingerprint；quality control；application

牛奶是嬰幼兒早期除母乳外的唯一來(lái)源，其質(zhì)量關(guān)系到孩子的生命安全。然而近年來(lái)，一些因奶粉質(zhì)量問(wèn)題而引發(fā)的事件層出不窮，如安徽阜陽(yáng)的“毒奶粉”事件，“三聚氰胺奶粉事件”，圣元的“激素門”，以及最近的“皮革奶”等。因此，迫切需要生產(chǎn)企業(yè)建立有效的檢測(cè)手段和有力的質(zhì)量保障體系，提供更優(yōu)質(zhì)、安全、放心的乳制品。目前奶粉的鑒別方法主要有肉眼等感官鑒別法、化學(xué)分析法、中紅外光譜分析法、紫外線吸收光譜法、近紅外光譜分析法、超聲波檢測(cè)法等[1]。但是這些方法大多存在不足，一般只是測(cè)定乳制品中的單個(gè)組分或幾個(gè)組分，不能將多個(gè)組分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，難以從本質(zhì)上、宏觀上、整體上綜合分析乳制品的質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)是一種快速、有效、全面的測(cè)定方法，強(qiáng)調(diào)的是圖譜的完整面貌即整體性，反映的質(zhì)量信息是綜合性的。特別是在復(fù)雜體系中，指紋圖譜能客觀反映事物的全貌，是單一指標(biāo)成分鑒定方法不可比擬的。不同地域的原料乳或不同廠家生產(chǎn)的乳制品都具有各自獨(dú)特的風(fēng)味組成以及所含菌落的差異性，以區(qū)別于其它產(chǎn)品，即有自己獨(dú)一無(wú)二的“指紋特征”。本文借用中藥、白酒、香料等成熟的指紋圖譜技術(shù)，探索指紋圖譜技術(shù)在乳制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用。與單一成分作為控制指標(biāo)的質(zhì)量方法相比，指紋圖譜可以很好地適應(yīng)乳制品成分復(fù)雜的特點(diǎn)。指紋圖譜技術(shù)不僅可以評(píng)價(jià)乳制品的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，也可以判斷乳制品質(zhì)量的穩(wěn)定性以及制備工藝的合理性。

1 指紋圖譜技術(shù)的特點(diǎn)

指紋圖譜技術(shù)是指樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理后，采用一定的分析方法，得到能夠顯示該樣品特性的譜圖，這些圖譜就像人的指紋一樣具有專一性和代表性，且盡可能多地反映樣品的全貌，所以被稱之為指紋圖譜。

其特點(diǎn)在于：特征性和專屬性：通過(guò)指紋圖譜能有效鑒別樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地；可量化性：由主要特征峰的面積或比例，能有效控制樣品質(zhì)量，確保樣品質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定；穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和再現(xiàn)性：由圖譜采集環(huán)境或者分析測(cè)試手段決定；有效性：這應(yīng)與產(chǎn)品相聯(lián)系，并且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上其數(shù)據(jù)有鑒別意義；完整性：表現(xiàn)多成分之間的相互關(guān)系；模糊性：成分間的協(xié)同交互作用復(fù)雜，故采用模糊數(shù)學(xué)的分析手段解決實(shí)際問(wèn)題[2]。

2 指紋圖譜技術(shù)的研究方法

指紋圖譜技術(shù)的研究方法主要包括：色譜法：傳統(tǒng)的薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法和高效毛細(xì)管電泳法等；光譜法：紫外光譜法和紅外光譜法等；波譜法：質(zhì)譜法和核磁共振法等；其他方法：如X射線衍射法，分子生物學(xué)方法等[3]。其中色譜法是公認(rèn)的應(yīng)用最廣也是最成熟的指紋圖譜技術(shù)的研究方法。

氣相色譜法（GC）主要用于分析氣體、揮發(fā)性和半揮發(fā)性液體以及能夠產(chǎn)生足夠蒸汽壓的固體，或者沸點(diǎn)在500℃以下，相對(duì)分子質(zhì)量400u以下的物質(zhì)。GC的特點(diǎn)是靈敏度高、分離度好、分析速度快[4]。

高效液相色譜法（HPLC）是一種具有高靈敏度、高選擇性、高效、快速的分離分析技術(shù)。它給出的是高分辨率的輪廓圖譜，重現(xiàn)性好、操作相對(duì)容易、在線操作外界影響因素小、色譜穩(wěn)定性好，是目前指紋圖譜研究應(yīng)用最多的一項(xiàng)技術(shù)[5]。

DNA指紋圖譜技術(shù)屬于分子生物學(xué)方法的范疇，可用于鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)?。由于同種生物體具有相同的DNA序列，生物的不同個(gè)體或不同種群在DNA結(jié)構(gòu)上存在著差異，可依據(jù)此來(lái)鑒定生物物種。隨著微量DNA提取技術(shù)和PCR擴(kuò)增、RAPD隨機(jī)擴(kuò)增標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，使DNA的提取更加便捷準(zhǔn)確。在分子水平上檢測(cè)基因多態(tài)性，比形態(tài)、組織和化學(xué)水平上檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

3 指紋圖譜的構(gòu)建

指紋圖譜的構(gòu)建步驟為：

a.樣品采集：考慮到樣品批次不同所導(dǎo)致的差異，要在一定數(shù)量的樣品中，選擇合適數(shù)量的樣品進(jìn)行檢測(cè)。一般要求至少六個(gè)批次的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，把獲取的原始圖譜（圖像）進(jìn)行平均，得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜[6]。

b.圖譜數(shù)據(jù)的采集：樣品經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)預(yù)處理，選取適當(dāng)?shù)姆椒ń⒅讣y圖譜，進(jìn)一步確定該方法所對(duì)應(yīng)的各項(xiàng)參數(shù)。例如，采用色譜法進(jìn)行指紋圖譜分析，則要確定進(jìn)樣方式和進(jìn)樣量以及所使用的色譜條件，包括色譜柱的選擇、載氣、溫度、流速、質(zhì)譜條件等[7]。

c.數(shù)據(jù)分析：對(duì)獲得的圖譜進(jìn)行比較分析，尋找分離好、分辨率高、重現(xiàn)性好的圖譜，進(jìn)行圖譜辨認(rèn)和評(píng)價(jià)，找出具有規(guī)律性的“共性”和“個(gè)性”。常用的數(shù)據(jù)分析方法有：直觀比較法、量化數(shù)據(jù)比較法、化學(xué)模式識(shí)別法、計(jì)算機(jī)軟件分析等[8]。

4 指紋圖譜技術(shù)在乳制品中的應(yīng)用

4.1 特征鑒定

不同區(qū)域的原料乳或不同品牌的乳制品，由于地理分布、氣候條件等環(huán)境因素的不同和地域文化特征的差異，其中所含揮發(fā)性物質(zhì)的含量和比例以及所含菌落的多樣性和差異性也不盡相同。它們的指紋圖譜會(huì)表現(xiàn)出相同的特征，也就是共性部分，當(dāng)然也會(huì)有部分指紋圖譜的表現(xiàn)不同，這就是決定原料乳或成品獨(dú)有的個(gè)性部分，需經(jīng)鑒別系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步的識(shí)別。不同的地區(qū)或不同的奶源基地可以建立各地收奶地區(qū)的指紋圖譜庫(kù)，以表現(xiàn)不同的地方特色，而且不同產(chǎn)地的原料乳或成品將組成全國(guó)的乳制品指紋圖譜庫(kù)。

據(jù)報(bào)道采用固相微萃取-氣相色譜-頂空-質(zhì)譜（SPME-GC-HS-MS）法，不經(jīng)前處理，可直接對(duì)奶油進(jìn)行分析，其質(zhì)量指紋圖譜既可用于鑒別進(jìn)口新西蘭天然奶油，也可用于鑒別不同生產(chǎn)國(guó)所生產(chǎn)的天然奶油[9]。

C Fernandez等人分別于春夏冬三季在法國(guó)的高原地帶（奧弗涅山脈）和較低地區(qū)（布列塔尼半島）共收集有代表性的原料乳樣品35個(gè)。乳脂肪中提取的單萜烯類和倍半萜類物質(zhì)采用頂空氣質(zhì)聯(lián)用法定量，通過(guò)多因辨別分析將原料乳樣品分類。發(fā)現(xiàn)奧弗涅高地的原料乳較布列塔尼半島含有更多的倍半萜，全部樣本按照原產(chǎn)地域正確歸類，不受其季節(jié)性畜群管理模式的影響。根據(jù)地域范圍和生產(chǎn)條件，通過(guò)萜烯混合物可以得到有價(jià)值的乳制品特征指紋圖譜[10]。

I Bonizzi等人通過(guò)16S-23S ITS-PCR技術(shù)，建立了高山牧場(chǎng)、低地牧場(chǎng)所產(chǎn)原料乳中微生物群落的指紋圖譜，該指紋圖譜可表現(xiàn)生物多樣的特征。結(jié)果表明生產(chǎn)意大利干酪的阿爾卑斯山地區(qū)的原料乳包含了各種各樣的細(xì)菌群落，而細(xì)菌群落的組成與牧場(chǎng)的海拔有關(guān)[11]。

4.2 摻假識(shí)別

部分奶農(nóng)或奶站為牟取暴利，添加三聚氰胺、皮革蛋白等以次充好，以假亂真，利用指紋圖譜技術(shù)可以有效打擊乳制品的制假售假。首先，根據(jù)季節(jié)等外界因素的不同，選取足夠多的樣本，以其出峰的先后順序及相對(duì)含量的多少為特征，建立本地區(qū)穩(wěn)定的原料乳基礎(chǔ)指紋圖譜庫(kù)；其次，以基礎(chǔ)指紋圖譜庫(kù)為參照，將被鑒別的樣本指紋圖譜與基礎(chǔ)指紋圖譜庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)出峰數(shù)量、保留時(shí)間、峰形大小等參數(shù)對(duì)圖譜進(jìn)行定性識(shí)別，尋找是否存在差異的未知峰；最后，參數(shù)吻合則為合格，如果存在差異峰則需進(jìn)一步的深入研究，選取合適的內(nèi)標(biāo)物應(yīng)用質(zhì)譜將未知峰定性。

曾慶方等人通過(guò)建立牛奶的HPLC-MS指紋圖譜，提取原料奶的特征信息，在樣品分析后的特征信息中扣除本底數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的參考值，對(duì)異常參數(shù)值進(jìn)行分析、確證，找出異?；衔铩PLC-MS指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于牛奶中有害藥物篩查，較之用單一成分或指標(biāo)監(jiān)控，其質(zhì)量更具有科學(xué)性、全面性和可追溯性，也從根本上解決了其他現(xiàn)有分析技術(shù)必須多種方法結(jié)合使用以及多項(xiàng)指標(biāo)必須同時(shí)檢測(cè)才能對(duì)其質(zhì)量合格與否做出判斷的弊端，大大提高了質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)的技術(shù)水平和科技含量[12]。

王顏紅等人采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了原料奶指紋圖譜，在一定程度上客觀反映了原料奶的整體質(zhì)量特征。在此基礎(chǔ)上，選取有代表性有害物如防腐劑苯甲酸等進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)添加，建立了危害物的標(biāo)準(zhǔn)添加圖譜，對(duì)沈陽(yáng)地區(qū)超市的50個(gè)純牛奶樣品進(jìn)行了篩查，取得初步應(yīng)用結(jié)果，為原料奶的質(zhì)量控制和奶制品中有害物篩查體系的研究提供了方法學(xué)參考[13]。

4.3 質(zhì)量的過(guò)程控制

在保證了上游奶源質(zhì)量安全的基礎(chǔ)上，指紋圖譜技術(shù)同樣也可以應(yīng)用在乳制品質(zhì)量過(guò)程控制和出廠檢驗(yàn)。指紋圖譜的特征可以反映半成品或成品內(nèi)在質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，又能表現(xiàn)各批次間的差異性，是判定原輔料及產(chǎn)成品質(zhì)量穩(wěn)定的重要手段。因此，乳制品生產(chǎn)企業(yè)可以建立自己的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，以此來(lái)指導(dǎo)生產(chǎn)、優(yōu)化工藝、降低成本、實(shí)現(xiàn)利潤(rùn)最大化。

袁潔等人認(rèn)為指紋圖譜相似度是利用色譜流出曲線中保留時(shí)間對(duì)色譜峰進(jìn)行匹配，然后對(duì)匹配峰進(jìn)行比值計(jì)算，綜合計(jì)算出圖譜之間的相似度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品差異程度的評(píng)價(jià)。既可評(píng)價(jià)產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性，又可評(píng)價(jià)產(chǎn)品之間的差異性，具有直觀、全面的優(yōu)點(diǎn)[14]。

I Proudy等人收集并歸類了200個(gè)分離的阪崎腸桿菌，其中70%表現(xiàn)出相同的指紋圖譜，表示在生產(chǎn)環(huán)境中有阪崎腸桿菌的存在。此方法可用于發(fā)現(xiàn)干混營(yíng)養(yǎng)素方法生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉中微生物的污染，同時(shí)，可實(shí)現(xiàn)一系列其他的控制管理，以減少最終產(chǎn)品受阪崎腸桿菌的污染[15]。

J Banykó等人采用PCR分析提取分離的芽孢桿菌，單引物定向擴(kuò)增各物種的box重復(fù)序列作為特征序列，生乳和巴氏殺菌乳中所被污染的蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌菌種不同，而且乳制品生產(chǎn)過(guò)程中存在的一些BOX類型在原料乳中卻沒(méi)有。BOX-PCR指紋圖譜技術(shù)可以表征乳制品生產(chǎn)環(huán)境中桿菌的菌群，因此可用作證實(shí)環(huán)境是否被污染以及牛奶生產(chǎn)過(guò)程中桿菌的繁殖[16]。

4.4 微生物的檢測(cè)

通過(guò)指紋圖譜技術(shù)檢測(cè)乳制品中的乳酸菌，可實(shí)現(xiàn)乳酸菌組成及濃度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，進(jìn)而反映產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。此外，原料乳及乳制品在加工、運(yùn)輸和流通等環(huán)節(jié)都有可能受到雜菌的污染，應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)可鑒定有害微生物菌種的組成、預(yù)測(cè)環(huán)境微生物可能存在的污染風(fēng)險(xiǎn)等。

李武等人利用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)對(duì)市售某品牌酸奶進(jìn)行了一個(gè)月的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，共收集了6個(gè)生產(chǎn)批次的18個(gè)酸奶樣品，結(jié)合常規(guī)分離培養(yǎng)方法，對(duì)樣品微生物組成及其穩(wěn)定性進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示所有供試樣品在整個(gè)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)期內(nèi)DGGE指紋圖譜都出現(xiàn)2條帶，其微生物組成比較穩(wěn)定，分別為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。通過(guò)菌種組成及其穩(wěn)定性兩個(gè)指標(biāo)對(duì)酸奶樣品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，該技術(shù)可以作為酸奶質(zhì)量控制和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的快速、簡(jiǎn)便的新方法[17]。

靳淼等人對(duì)引進(jìn)直投型酸奶發(fā)酵劑（DVS）中乳桿菌進(jìn)行分離鑒定，利用MRS半選擇性培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行分離，采用糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、全細(xì)胞蛋白電泳和RAPD指紋圖譜三種方法對(duì)其鑒定。結(jié)果表明，引進(jìn)直投型酸奶發(fā)酵劑中乳桿菌由兩株菌構(gòu)成[18]。

B E Gillespie等人使用聚合酶鏈反應(yīng)為基礎(chǔ)的DNA指紋圖譜技術(shù)，將美國(guó)田納西州和新西蘭的牛乳房分泌物中分離出的停乳鏈球菌和乳房鏈球菌進(jìn)行分類。數(shù)據(jù)表明新西蘭的停乳鏈球菌和乳房鏈球菌與美國(guó)田納西州截然不同，認(rèn)為DNA指紋圖譜技術(shù)可以作為一個(gè)流行病學(xué)的工具，用來(lái)區(qū)分鏈球菌，同時(shí)可以鑒定農(nóng)場(chǎng)中乳腺炎病原菌的來(lái)源[19]。

Robin M等人研究了脫脂乳粉、嬰兒配方奶粉、卵磷脂、可可粉等食品，每種食品的PCR指紋圖譜經(jīng)過(guò)電泳分析，該譜帶與產(chǎn)腸毒素的芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的DNA指紋圖譜有關(guān)。利用rep-PCR得到的DNA指紋圖譜不僅是確定細(xì)菌基因類型的工具，也是食品微生物學(xué)中質(zhì)量控制和衛(wèi)生監(jiān)測(cè)的獨(dú)特方法[20]。

5 應(yīng)用前景

隨著人們生活水平的提高，乳制品已經(jīng)走進(jìn)了千家萬(wàn)戶，以其營(yíng)養(yǎng)豐富、口味獨(dú)特、品種多樣等特點(diǎn)吸引著越來(lái)越多的消費(fèi)者。面對(duì)如此龐大的乳制品消費(fèi)市場(chǎng)，保證乳制品質(zhì)量安全顯得非常重要。指紋圖譜技術(shù)對(duì)于乳制品這種特殊復(fù)雜的物質(zhì)來(lái)說(shuō)，可以實(shí)現(xiàn)多組分、多指標(biāo)同時(shí)測(cè)定，在特征的鑒定，摻假的鑒別，質(zhì)量的過(guò)程控制等方面應(yīng)用較廣，真正實(shí)現(xiàn)從原料、配方到生產(chǎn)工藝及產(chǎn)成品全方位的穩(wěn)定、可控。指紋圖譜技術(shù)在乳制品中的應(yīng)用研究雖然起步較晚，但是從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，其將成為乳制品質(zhì)量控制新的發(fā)展方向。

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Application of fingerprint technology in dairy production quality control

FAN Ping，ZHANG Ren-ming，HE Wu-ming，XIAO Lian-rong，REN Guo-pu*
（Hunan AVA Dairy CO.，Ltd.，Changsha 410200，China）

TS252.1

A

1002-0306（2012）13-0417-04

2011－05－18 *通訊聯(lián)系人

樊萍（1982-），女，碩士研究生，助理工程師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與儲(chǔ)藏。

長(zhǎng)沙市重大專項(xiàng)（K1003191-21）。