王 偉，徐 敏

(1.咸寧學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室，湖北咸寧437100;2.湖北省鄂鋼醫(yī)院)

蛋白酶/抗蛋白酶失衡假說(shuō)已成為公認(rèn)的與肺疾病(如慢性阻塞性肺病、肺纖維化等)發(fā)病有關(guān)的機(jī)制之一［1］。有研究顯示［2］，TIMP－2 基因 +853位點(diǎn)多態(tài)性與慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的易感性有關(guān)，特別是當(dāng)吸煙者存在等位基因G時(shí)易患COPD。本研究通過(guò)分析肺組織中TIMP－2基因多態(tài)性的改變與蛋白質(zhì)表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)一步探討TIMP－2基因多態(tài)性的改變?cè)贑OPD發(fā)病中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

選擇肺大泡、肺癌手術(shù)切除的無(wú)病變肺組織29份，其中肺大泡7例、肺癌22例，標(biāo)本立即置于－70℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 組織基因組DNA提取

取凍存的肺組織標(biāo)本30mg，采用組織DNA提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)提取組織基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)

引物(北京博大泰克公司合成):上游:5＇－GCCCAGGGTGTTCTGGATGG－ 3 ＇，下 游:5 ＇－CTCCGGCTGATGGCCCCACT－3＇，PCR 反應(yīng)體系為 50μl，取潔凈 PCR管依次加入 10×buffer 5μl，dNTP(10mmol/L)2μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，上游引物(10mmol/L)1μl，下游引物(10mmol/L)1μl，模板DNA 2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)2U(Promega公司提供)，ddH2O 35.6μl，PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 3min;變性 94℃ 45s;退火 66℃ 45s;72℃1min;共30個(gè)循環(huán);再72℃延伸10min。

1.2.3 酶切反應(yīng)

采用內(nèi)切酶BsrI(NEB公司)對(duì)+853位點(diǎn)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳，染色，在凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果確定基因型。

1.2.4 TIMP－2 蛋白的檢測(cè)

免疫組化SP法檢測(cè)肺組織TIMP－2蛋白的表達(dá):鼠抗人TIMP－2單克隆抗體，免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司，標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，包埋組織標(biāo)本作5μm連續(xù)切片，采用高溫直接煮沸法修復(fù)抗原，免疫組化SP法染色按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

在高倍顯微鏡(10×40)下觀察細(xì)胞著色程度，進(jìn)行半定量分級(jí)。TIMP－2均以實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒判斷為陽(yáng)性著色。高倍鏡下取4個(gè)不同視野，各計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分率分為(+～+++)。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性(－);陽(yáng)性細(xì)胞＜30%為(+)，呈淺黃色;陽(yáng)性細(xì)胞占30% ～50%為(++)，呈棕黃色;陽(yáng)性細(xì)胞 ＞50%為(+++)，呈棕褐色。用HMIAS－2000型高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對(duì)切片染色進(jìn)行定量檢測(cè)，測(cè)定肺組織陽(yáng)性著色的TIMP－2蛋白積分光密度值(A值)，在相同的倍數(shù)下計(jì)算平均A值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，頻率比較采用卡方檢驗(yàn)，蛋白定量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 TIMP－2基因+853位點(diǎn)產(chǎn)物PCR－RFLP結(jié)果

肺組織基因型頻率分布G/G型15例(51.7%)、G/A 型 9例(31.0%)、A/A 型 5例(17.2%)。

2.2 TIMP－2 蛋白的表達(dá)

TIMP－2蛋白表達(dá)半定量分級(jí)顯示G/G型陽(yáng)性率26.7%、G/A型陽(yáng)性率22.2%、A/A型陽(yáng)性率40%，表達(dá)無(wú)差異性(P＞0.05);TIMP－2蛋白定量檢測(cè)各型間亦無(wú)差異性(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類(lèi)能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)的內(nèi)肽酶，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是內(nèi)源性的MMPs組織特異性抑制劑，能調(diào)節(jié)MMPs活性，抑制 MMPs對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。研究表明［3，4］，與肺疾病相關(guān)的 TIMPs主要為 TIMP－1 和TIMP－2，而TIMP－2在肺組織有更強(qiáng)的對(duì)MMPs抑制作用，故MMPs/TIMP－2平衡有利于維持肺組織的正常形態(tài)，能阻止肺疾病的發(fā)生。

1996年，Hammani等確定人類(lèi) TIMP－2基因位于人類(lèi)第17號(hào)染色體長(zhǎng)臂17q23－17q25，全長(zhǎng)約83kb個(gè)堿基對(duì)，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子;其基因多態(tài)性表現(xiàn)為－418位點(diǎn)和+853位點(diǎn)，TIMP－2蛋白是一種非糖基化蛋白，以1∶1形式與IV型膠原蛋白酶(MMP－2)結(jié)合從人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞中分泌出來(lái)，分子量為21Ku，可以抑制MMPs家族所有成員的活性。以往研究顯示［2］，TIMP－2基因+853位點(diǎn)多態(tài)性表現(xiàn)為G/G型、G/A型、A/A型，其中G/G型與我國(guó)中部地區(qū)慢性阻塞性肺病易感性有關(guān)，多態(tài)性的改變可能影響TIMP－2蛋白。

本研究結(jié)果顯示，+853位點(diǎn)G/G型、G/A型、A/A型3種基因型TIMP－2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)，說(shuō)明蛋白質(zhì)的表達(dá)量在3種基因型之間無(wú)差異，基因型可能與蛋白質(zhì)的表達(dá)量無(wú)關(guān)。TIMP－2基因+853位點(diǎn)多態(tài)性與我國(guó)中部地區(qū)慢性阻塞性肺病易感性有關(guān)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］Teramoto S，Ishii T，Yamamoto H，et al.Xenobiotic enzymes and genetics of COPD［J］.Chest，2005，127(1):408

［2］王偉，徐敏，胡克.基質(zhì)金屬蛋白酶－2組織抑制劑基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺病易感性研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(22):3812

［3］Gualano RC，Vlahos R，Anderson GP.What is the contribution of respiratory viruses and lung proteases to airway remodelling in asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］.Pulm Pharmacol Ther，2006，19(1):18.

［4］Segura－Valdez L，Pardo A，Gaxiola M，et al.Upregulation of gelatinases A and B，collagenases 1 and 2，and increased parenchymal cell death in COPD［J］.Chest，2000，117(3):684