徐三

(東陽(yáng)市疾控中心 浙江東陽(yáng) 322100)

結(jié)核分枝桿菌的檢驗(yàn)與分型

徐三

(東陽(yáng)市疾控中心 浙江東陽(yáng) 322100)

目的結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)和分型。方法采用PCR及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù),針對(duì)124株結(jié)核分枝桿菌的6個(gè)可變重復(fù)位點(diǎn)做了檢驗(yàn),并應(yīng)用Gel－Proanalyzer3.0軟件及BioNumerics(Version3.0)軟件對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果做了相關(guān)的基因型分析,又分析了基因檢測(cè)與分型之間的關(guān)系。結(jié)果136株結(jié)核分枝桿菌共分為37個(gè)不同的VNTR類(lèi)型,成簇基因型占74.26%(101/136),單一基因型占25.74%(35/136)。結(jié)論耐藥菌株的檢測(cè)在分布上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)的差別。

結(jié)核分枝桿菌 檢驗(yàn) 分型

在分子生物學(xué)發(fā)展的今天,我們通常利用可變數(shù)目串聯(lián)重(variablenumbertan demrepeat,VNTR)分型技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢驗(yàn)與分型,它具有操作簡(jiǎn)單,分型信息為數(shù)字型的,是可以重復(fù)的,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)與實(shí)驗(yàn)室間具有可比性,所以用大量樣本做了分析,通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢驗(yàn)和檢測(cè),得出的結(jié)核桿菌的檢驗(yàn)與分型數(shù)據(jù),也為各項(xiàng)研究提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株的來(lái)源

菌株的來(lái)源：由結(jié)核病防治所提供的136株結(jié)核分枝桿菌菌株,通過(guò)臨床分離株進(jìn)行分析。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP、GoldViewTMDNA染料的準(zhǔn)備;實(shí)驗(yàn)中所用PCR材料的準(zhǔn)備;100bpDNAladder的購(gòu)進(jìn)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

生物安全柜、臺(tái)式高速離心機(jī)、培養(yǎng)箱、DNA的自動(dòng)擴(kuò)增儀、恒壓恒流電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)。

1.4 所用到的軟件

BioNumerics方面的,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的軟件;利用SPSS做統(tǒng)計(jì)工作的軟件。

2 結(jié)果

(1)對(duì)136株臨床分離株的菌種進(jìn)行鑒定后的結(jié)果。利用PNB及TCH對(duì)136株臨床分離菌做實(shí)驗(yàn),利用它在培養(yǎng)基中所出現(xiàn)的問(wèn)題對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌做進(jìn)一步的分析,得到的最后結(jié)果：136株臨床分離株被鑒定為結(jié)核分枝桿菌。

(2)136株結(jié)核分枝桿菌的藥敏結(jié)果。在對(duì)菌株研究的過(guò)程中,所得到的結(jié)果是：完全敏感菌株有102株,占75%(102/136),耐藥菌株34株,占到最25%(34/136)。

(3)136株結(jié)核分枝桿菌VNTR結(jié)果。在有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)家進(jìn)行了研究以后,我又選用了8個(gè)基因位點(diǎn)做了進(jìn)一步的研究,對(duì)這里選用的136株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了相關(guān)的檢驗(yàn),也H37RV做了相關(guān)數(shù)據(jù)的對(duì)照,得用100bpDNAMarker進(jìn)行了分子量的對(duì)比,主要表現(xiàn)為11個(gè)分子量的標(biāo)準(zhǔn)帶,數(shù)據(jù)顯示如下100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000bp及1500bp。通過(guò)上面的結(jié)果可以知道存在于同一位點(diǎn)的擴(kuò)增片段的大小是不同的,菌株在不同位點(diǎn)的DNA指紋圖譜具有多態(tài)的特性。

(4)菌株的VNTR位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)重復(fù)出現(xiàn),這里的重復(fù)次數(shù)及位點(diǎn)的等位基因其具有的多態(tài)性不同而出現(xiàn)不同的VNTR指紋圖譜,可以根據(jù)別的待檢驗(yàn)菌株的DNA條帶為選點(diǎn),對(duì)分子量大小做出分析與統(tǒng)計(jì),再以每個(gè)菌株位點(diǎn)的不同,根據(jù)重復(fù)次數(shù)再進(jìn)行計(jì)算。這樣可以得出136株結(jié)核分枝桿菌的等位基因的多態(tài)性,結(jié)果顯示為：各位點(diǎn)具有不同的等位基因的多態(tài)性,而MTUB21位點(diǎn)的多態(tài)性相對(duì)高一些,即0.575,ETR－B位點(diǎn)的多態(tài)性相對(duì)低一些,即0.309。

3 討論

此項(xiàng)研究是對(duì)結(jié)核患者的136株結(jié)核分枝桿菌的基因分型與檢驗(yàn),以上結(jié)果表明了該地區(qū)耐藥結(jié)核分枝桿菌在臨床分離菌株中占有一定的比例(25%),比我國(guó)在2000年所做的結(jié)核病流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果要低,這里的耐藥結(jié)核的預(yù)防和控制在所有的結(jié)核病治療、預(yù)防和控制中有著重要的意義,特別是對(duì)耐多藥結(jié)核病的預(yù)防與控制顯得特別重要。

3.1 結(jié)核病患者的VNTR指紋特征的多態(tài)性分析

在該研究中對(duì)6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了研究,對(duì)VNTR基因進(jìn)行了分析,對(duì)菌株的等位基因的多態(tài)性做出了統(tǒng)計(jì)與分析以后,得到了6個(gè)位點(diǎn)的等位基因分別具有多態(tài)性這一特點(diǎn),它的多態(tài)性在0.309～0.575之間。這一項(xiàng)結(jié)果是在VNTR基因分型技術(shù)所得到的,它為可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列的篩選及確定提供了可靠的數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)6個(gè)VNTR位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)與分析,在BioNumerics軟件的輔助下,做了聚類(lèi)的分析,136株結(jié)核分枝桿菌中有37個(gè)基因型。有34(25%)位患者的分離株可確定為單一基因型。

3.2 VNTR類(lèi)型與成簇的關(guān)系分析

在研究中對(duì)初治結(jié)核病患者的顯示了較高的成簇率,顯示出該地區(qū)的結(jié)核病患者相互間有所感染,當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病發(fā)病有復(fù)燃現(xiàn)象,而復(fù)治的結(jié)核病患者的成簇率較低,大概是因?yàn)閮?nèi)源性復(fù)燃所導(dǎo)致,也就是因?yàn)橹委熓∷?有些不是續(xù)發(fā)所導(dǎo)致。

[1]孫冰梅,車(chē)志宏.結(jié)核分枝桿菌耐藥的分子機(jī)制及耐藥基因檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].山西醫(yī)藥雜志,2005,4(4)：301～303.

[2]朱中元,陳貽平,王海波,等.耐多藥結(jié)核分枝桿菌基因變異研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2000,23：26～28.

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1672-5654(2012)03(a)-0034-01

2012-02-15