賀 文，陳金湘

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128)

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物和紡織工業(yè)的重要原料，發(fā)展棉花產(chǎn)業(yè)，對(duì)提高棉農(nóng)經(jīng)濟(jì)收入、發(fā)展紡織工業(yè)和改善人們衣著水平有著密切關(guān)系［1］。蟲(chóng)害是制約棉花高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素，常規(guī)化學(xué)藥劑防治蟲(chóng)害的同時(shí)，使棉蟲(chóng)產(chǎn)生抗性，同時(shí)污染了生態(tài)環(huán)境，增加生產(chǎn)成本。20世紀(jì)80年代生物工程技術(shù)飛速發(fā)展，為培育抗病蟲(chóng)性強(qiáng)、纖維品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高的雜交棉品種提供了技術(shù)保障，尤其是培育成功的轉(zhuǎn)Bt基因棉——其表達(dá)產(chǎn)生的δ－內(nèi)毒素具有對(duì)鱗翅目等目標(biāo)昆蟲(chóng)毒力高、專(zhuān)一性強(qiáng)、且在棉株體內(nèi)修飾后表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，促使轉(zhuǎn)Bt基因棉成為世界上轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模商業(yè)化種植的主要作物之一，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。深入研究轉(zhuǎn)Bt基因在棉株各組織、器官中Bt毒蛋白的表達(dá)量及抗蟲(chóng)特點(diǎn)，旨在揭示轉(zhuǎn)Bt基因棉Bt毒蛋白表達(dá)含量的基本規(guī)律及明確對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)毒殺性，為轉(zhuǎn)Bt基因棉品種(組合)的選育、繁殖、推廣和安全評(píng)價(jià)管理提供科學(xué)的依據(jù)［2］。

1 Bt毒蛋白檢測(cè)方法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)因其操作相對(duì)簡(jiǎn)便、快速和檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛研究和應(yīng)用［3］。該方法主要是基于抗原、抗體特異性結(jié)合以及標(biāo)記酶的高效催化原理而建立的檢測(cè)微量蛋白的方法。ELISA檢測(cè)方法可分為:直接ELISA、間接ELISA、雙抗夾心法［4］。該項(xiàng)技術(shù)需要固定相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和酶作用底物等3種試劑。其免疫分析過(guò)程為:首先將抗原(Antigen)或抗體(Antibody)結(jié)合到固相載體里，待測(cè)溶液中的特殊抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面后，使酶標(biāo)記抗球蛋白與抗體或抗原化合物結(jié)合，結(jié)合物通過(guò)酶標(biāo)記物和底物顏色的改變而被檢測(cè)，通過(guò)最后溶液顏色深淺進(jìn)行定量測(cè)定(溶液顏色的深淺與原待測(cè)中的抗原與抗體的量成正比例)，從而應(yīng)用吸光度值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系計(jì)算抗原(抗體)的量。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western Bloting)

蛋白質(zhì)印跡被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì))上，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。通常有兩種:毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法［5］。其一般步驟為:1)蛋白樣品的制備;2)SDS－PAGE電泳;3)轉(zhuǎn)膜(PVDF或NC膜)與顯色。

1.3 免疫試紙條法

免疫層析試紙條技術(shù)是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來(lái)的基于免疫學(xué)方法的快速檢測(cè)技術(shù)，其原理是基于抗原抗體反應(yīng)來(lái)檢測(cè)待檢物，結(jié)構(gòu)主要包括樣本墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜(NC膜)、檢測(cè)線(T線)、質(zhì)控線(C線)、吸水墊及黏性底板等幾個(gè)部分組成。依據(jù)其免疫層析反應(yīng)時(shí)抗原與抗體結(jié)合方式的不同，免疫層析試紙條主要分為兩類(lèi):雙抗夾心免疫層析法和競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法［6］。

1.4 生物測(cè)定

生物測(cè)定法是目前最為廣泛采用的鑒定方法，其原理是利用不同昆蟲(chóng)對(duì)毒蛋白的不同敏感性或者同一昆蟲(chóng)的不同死亡率來(lái)進(jìn)行的，抗蟲(chóng)性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)束春娥［7］等的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，棉花植株的抗蟲(chóng)性以棉鈴蟲(chóng)的實(shí)際死亡率和校正死亡率表示，計(jì)算方法分別為:棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)實(shí)際死亡率=死蟲(chóng)數(shù)/(死蟲(chóng)數(shù)+活蟲(chóng)數(shù))×100%;棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)校正死亡率=(處理死亡率－對(duì)照死亡率)/(1－對(duì)照死亡率)×100%。高抗表現(xiàn)為幼蟲(chóng)校正死亡率＞80%，葉片被害呈Ⅰ級(jí)，活幼蟲(chóng)1～2齡;中抗則表現(xiàn)為幼蟲(chóng)校正死亡率60% ～79%，葉片被害呈Ⅱ級(jí)，活幼蟲(chóng)2齡;低抗表現(xiàn)為幼蟲(chóng)校正死亡率＜59%，葉片被害呈Ⅲ級(jí)，活幼蟲(chóng)2～3齡。

2 轉(zhuǎn)Bt基因棉花毒蛋白表達(dá)規(guī)律及其影響因素

自轉(zhuǎn)Bt基因棉問(wèn)世以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員通過(guò)免疫化學(xué)測(cè)定法、生物測(cè)定法等對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉花不同組織、器官的毒蛋白變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Bt毒蛋白在所有檢測(cè)到的器官中均有表達(dá)，轉(zhuǎn)Bt基因棉花Bt毒蛋白含量及其對(duì)棉鈴蟲(chóng)的抗性均呈明顯的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。

2.1 空間動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

轉(zhuǎn)Bt基因棉花發(fā)育的同一階段不同組織、器官中Bt毒蛋白含量、抗蟲(chóng)性不一致，并隨著棉株發(fā)育而變化，但總體表現(xiàn)為:營(yíng)養(yǎng)器官Bt毒蛋白的含量和殺蟲(chóng)活性均高于生殖器官。王保民等［8］經(jīng)過(guò)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)棉花葉片中的Bt毒蛋白含量顯著性高于蕾、花、鈴，果枝葉中Bt毒蛋白含量的變化規(guī)律與主莖葉基本相同。趙奎軍等［9］研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因棉GK－12品系相同部位葉片的殺蟲(chóng)活性隨著棉花生育期推移呈下降的趨勢(shì)，尤其在盛花期之后顯著降低;不同器官殺蟲(chóng)活性的順序?yàn)?葉＞蕾＞鈴＞花。孫偉等［10］用抗體夾心ELISA技術(shù)測(cè)定，Bt毒蛋白含量在苗期葉片中最高，蕾期次之，花鈴期最低。Sivasupramaniam S等［11］用酶聯(lián)免疫法分別測(cè)定轉(zhuǎn) Cry1Ac、Cry2Ab2棉 株 各 個(gè) 組 織 Cry1Ac、Cry2Ab2毒蛋白含量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)Cry1Ac毒蛋白表達(dá)量在頂葉中最高，在完全葉、花萼、苞葉中較低，但轉(zhuǎn)Cry2Ab2毒蛋白表達(dá)量在幼鈴中最高，完全葉、花萼、苞葉中較低。

2.2 時(shí)間動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

隨著時(shí)間的變化，轉(zhuǎn)Bt棉花整個(gè)生育階段棉花的各個(gè)組織、器官中Bt毒蛋白的含量和抗蟲(chóng)性都有較大的差異，測(cè)定的結(jié)果也不盡相同，但總體表現(xiàn)為棉株生育前期植株生長(zhǎng)旺盛，其Bt毒蛋白表達(dá)量高、殺蟲(chóng)活性強(qiáng);隨著棉株生長(zhǎng)發(fā)育的推移，其Bt毒蛋白表達(dá)量顯著下降，其殺蟲(chóng)活性急劇降低。陳松等［12］發(fā)現(xiàn)隨著棉花生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，Bt毒蛋白在葉片中的表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱，其中以苗期葉片中最高，蕾期次之，花鈴期最低。李汝忠、沈法富［13］的研究表明，Bt毒蛋白的表達(dá)強(qiáng)度從苗期到蕾期呈上升趨勢(shì)，至蕾期達(dá)到高峰，以后逐漸減弱。陳鵬等［14］采用ELISA法(酶鏈免疫法)研究和分析了單價(jià)(Bt)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及雙價(jià)(Bt/CpTI)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉不同生育期以及花鈴期不同器官的殺蟲(chóng)蛋白含量，發(fā)現(xiàn)在時(shí)間分布上，各生育期頂尖平展葉表現(xiàn)為:初花期＞蕾期、花鈴期＞苗期＞吐絮期。周曉梅等［15］用 Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac 平板試劑盒檢測(cè)了兩種轉(zhuǎn)Cry1Ac基因棉花品系(NUCOTN33B、NUCOTN99B)以及常規(guī)對(duì)照品系(蘇棉12)不同生育期主莖嫩葉、側(cè)枝嫩葉、蕾及蕾的苞葉中殺蟲(chóng)蛋白Cry1Ac的含量，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)Bt基因棉主莖嫩葉殺蟲(chóng)蛋白Cry1Ac的含量隨生育期的推移呈明顯下降趨勢(shì)，花鈴期(NUCOTN33B和NUCOTN99B分別為4.43、2.93 μg/g)和吐絮期(3.87 和 2.86 μg/g)的含量分別降至苗期第 6葉(7.64、8.38 μg/g)的58%、35%和51%、34%;相同時(shí)期的主莖嫩葉和側(cè)枝嫩葉中Cry1Ac的含量均顯著高于蕾及蕾的苞葉，前兩者均為后兩者的兩倍以上。Chen F等［16］試驗(yàn)證明了棉花不同生育階段有不同的Bt毒蛋白表達(dá)量;通過(guò)提升田間CO2濃度含量可以促使轉(zhuǎn)Bt基因棉花生物量增加，但會(huì)導(dǎo)致Bt外源毒素表達(dá)含量減少;通過(guò)對(duì)出苗后45 d和90 d棉株莖、嫩枝毒蛋白測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨著棉花生物量顯著增加，Bt毒蛋白表達(dá)量減少，但是對(duì)出苗后90 d Bt棉葉和鈴檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其Bt毒蛋白無(wú)顯著性變化。Guo WZ等［17］通過(guò)測(cè)定棉株不同生育時(shí)期主莖上葉片毒蛋白含量和抗蟲(chóng)鑒定，隨著棉株生育期推移，Bt毒蛋白含量呈下降趨勢(shì)，其對(duì)棉鈴幼蟲(chóng)毒殺率也逐漸降低。Bird LJ等［18］通過(guò)溫室測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Cry1Ac棉表達(dá)毒蛋白在出苗15周后其毒蛋白表達(dá)含量與出苗4周相比降低了75%，不足10%的棉鈴幼蟲(chóng)發(fā)育到了第五代，而室內(nèi)轉(zhuǎn) Cry1Ac棉株上棉鈴成蟲(chóng)存活率為62%，F(xiàn)1代棉鈴幼蟲(chóng)存活率為39%。

2.3 影響轉(zhuǎn)Bt基因Bt毒蛋白表達(dá)及抗蟲(chóng)性的因素

轉(zhuǎn)Bt基因Bt毒蛋白表達(dá)及抗蟲(chóng)性具有時(shí)空特異性，這表明轉(zhuǎn)Bt基因棉花中Bt毒蛋白的表達(dá)受棉株體內(nèi)發(fā)育調(diào)控和外界環(huán)境條件影響。其原因有以下幾個(gè)方面:1)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)水平受表達(dá)載體的影響，啟動(dòng)子起關(guān)鍵作用，不同來(lái)源的啟動(dòng)子在不同基因中的表達(dá)效率有明顯差異。目前，在棉花Bt抗蟲(chóng)基因研究過(guò)程中，廣泛使用的35S啟動(dòng)子來(lái)源于花椰菜花葉病毒(CaMV35S)蛋白基因，此啟動(dòng)子在棉株體細(xì)胞內(nèi)具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，可以在棉株不同時(shí)期器官、組織內(nèi)表達(dá)對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)毒殺的蛋白，但不是特定階段表達(dá)型或蟲(chóng)害侵害誘導(dǎo)表達(dá)型，隨著棉花生長(zhǎng)生育后期棉株體內(nèi)表達(dá)毒蛋白顯著性下降，抗蟲(chóng)性變差。2)植物體內(nèi)轉(zhuǎn)入目的基因表現(xiàn)“沉默”現(xiàn)象已達(dá)成共識(shí)，轉(zhuǎn)Bt基因在棉株體內(nèi)的沉默可能與甲基化、轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)、插入受體裹包體位點(diǎn)及與受體中有同源基因等有關(guān)，使其表達(dá)水平低、不穩(wěn)定［29］。3)Bt毒蛋白的表達(dá)水平受降水、光強(qiáng)、溫度、栽培方式等條件影響，在低光強(qiáng)、高溫下棉株生長(zhǎng)旺盛時(shí)，抗性增加，反之則降低。降水也能夠降低Bt殺蟲(chóng)蛋白的毒性表達(dá)［29］。4)棉花本身特定的次生物(棉酚為代表的萜烯類(lèi)化合物和單寧類(lèi)化合物)也會(huì)對(duì)棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生影響，研究發(fā)現(xiàn)棉花縮合單寧和Bt毒蛋白之間有一定的拮抗作用，Bt殺蟲(chóng)蛋白表達(dá)會(huì)影響到棉花中縮合單寧的合成［30］。5)通過(guò)植物介導(dǎo)的RNAi(RNA interference)技術(shù)能夠有效下調(diào)目標(biāo)昆蟲(chóng)體內(nèi)特異基因的表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出抵御害蟲(chóng)的能力;將棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)代謝有關(guān)基因CYP6AE14特異的 dsRNA(double－stranded RNA)導(dǎo)入植物中表達(dá)，并用轉(zhuǎn)基因植物組織喂食棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)幼蟲(chóng)體內(nèi)CYP6AE14的表達(dá)水平降低，幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)得到抑制［31，32］。

3 問(wèn)題與展望

目前直接測(cè)定轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉株內(nèi)Bt毒蛋白的方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法、免疫試紙條法、生物試法。酶聯(lián)免疫法(ELISA)具有高特異性、靈敏性，檢測(cè)值可至ng～pg水平，但需特異性的抗體，且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。免疫印跡具有SDS－PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析，但操作步驟繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中須有良好的內(nèi)參體系，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差。免疫試紙條法檢測(cè)快速，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，適用快速檢測(cè)及診斷，但靈敏度偏低，要求采用純度高、親和力強(qiáng)的單克隆抗體以及新型發(fā)射光譜型標(biāo)記物并配合試紙條熒光讀取儀，才能提高免疫層析試紙條的靈敏度。有些轉(zhuǎn)基因棉株中Bt毒蛋白的表達(dá)量極低，甚至用ELISA和蛋白質(zhì)印跡法都難以測(cè)定，而且生物試驗(yàn)結(jié)果仍表現(xiàn)出對(duì)敏感昆蟲(chóng)的抗性。測(cè)定過(guò)程中需統(tǒng)一蟲(chóng)源、蟲(chóng)齡，且試驗(yàn)占用空間大，測(cè)定所需時(shí)間長(zhǎng)，昆蟲(chóng)飼養(yǎng)過(guò)程中易被病毒感染。鑒于全球轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)化迅猛發(fā)展，建立一種快速、高效、低成本、靈敏性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)法將成為今后研究的發(fā)展趨勢(shì)。

目前，轉(zhuǎn)Bt基因棉花中Bt毒蛋白表達(dá)的研究尚處于初級(jí)階段，研究人員對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉Bt毒蛋白含量的表達(dá)變化及抗蟲(chóng)性測(cè)定結(jié)果存在一定的差異，在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步深入開(kāi)展對(duì)外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的動(dòng)態(tài)表達(dá)機(jī)理，以及Bt毒蛋白表達(dá)水平與棉株體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物之間關(guān)系和害蟲(chóng)對(duì)Bt不同基因類(lèi)型產(chǎn)生毒蛋白交叉抗性的研究，并結(jié)合運(yùn)用“避難所”策略和天敵的協(xié)同作用，發(fā)揮轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉毒蛋白對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)防治的最佳效應(yīng)。

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