張 惠，劉愛(ài)華，臧恒昌，郭學(xué)平

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，山東 濟(jì)南 250101;3.國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250012)

近紅外光譜分析技術(shù)用于發(fā)酵工藝研究進(jìn)展

張 惠1，3，劉愛(ài)華2，臧恒昌1，3，郭學(xué)平2

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，山東 濟(jì)南 250101;3.國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250012)

近紅外光譜分析技術(shù)是近年來(lái)興起的分析技術(shù)，具有方便快速的特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。本文綜述了近紅外光譜分析技術(shù)在菌種選育及發(fā)酵過(guò)程參數(shù)控制等方面的研究進(jìn)展，并指出了各采樣方式的優(yōu)缺點(diǎn)。

近紅外光譜;菌種選育;發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

近紅外光譜(near infrared spectroscopy，NIRS)是介于可見(jiàn)光和中紅外之間的電磁輻射波譜，美國(guó)材料檢測(cè)協(xié)會(huì)(ASTM)將近紅外光譜定義為780～2 526 nm的光譜區(qū)域，主要反映有機(jī)分子中含氫基團(tuán)(O-H，N-H，C-H)振動(dòng)的基頻與合頻吸收，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)可用于物質(zhì)的定性和定量分析［1］。其方便、快速、高效、準(zhǔn)確和成本低的特點(diǎn)與美國(guó)食品藥品管理局(FDA)所提出的過(guò)程分析技術(shù)(process analytical technology，PAT)概念相符合，被廣泛用于一系列生產(chǎn)過(guò)程的過(guò)程控制［2-3］。近年來(lái)用于發(fā)酵工藝的研究也日益增多，本文對(duì)其研究近況進(jìn)行了綜述。

1 菌種選育

從自然界獲得的菌種，通過(guò)進(jìn)一步的菌種選育，不僅可為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)提供各種類型的突變株，提高發(fā)酵單位，還可以改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量，除去多余的代謝產(chǎn)物和合成新品種。但菌種選育過(guò)程中常常得到大量菌種，常規(guī)篩選方法效率低、進(jìn)展慢，而NIRS可用于對(duì)菌株進(jìn)行定性判別和定量分析，從而成為一種高通量篩選菌株的有效方法。Decker等［4］利用NIRS對(duì)生長(zhǎng)于奶酪基質(zhì)上的Penicillium camemberti不同菌株進(jìn)行判別，利用不同的光譜預(yù)處理方法結(jié)合判別式最小二乘回歸法(DPLS)，最終選擇溫度和波長(zhǎng)擴(kuò)展多元散射校正(temperature-and wavelength-extended multiplicative scatter cor-rection，TW-MSC)作為最佳分類結(jié)果的預(yù)處理方法。此預(yù)處理方法可有效降低溫度對(duì)于光譜的影響。同時(shí)Morita等［5］利用NIRS成功定性判別出基因修飾后的Saccharomyces cerevisiae的表型和基因型不同的菌株。

此外，建立菌株發(fā)酵產(chǎn)物的主要有效成分的定量分析模型也可用于篩選高產(chǎn)突變菌株。郭偉良等［6］將468株蛹蟲(chóng)草突變株在不同的搖瓶發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，收集菌絲體粉末樣品采集光譜，并建立光譜與有效成分含量間的相關(guān)模型，最終得到的模型具有很好的擬合度和預(yù)測(cè)性能。Morita等［5］建立了基因修飾后的Saccharomyces cerevisiae菌株發(fā)酵過(guò)程中消耗原料和產(chǎn)物生成量的定量模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明NIRS可快速準(zhǔn)確判斷菌株的發(fā)酵能力，因此可開(kāi)發(fā)成為高通量篩選菌株的有效工具。

2 發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)

過(guò)去使發(fā)酵過(guò)程達(dá)到高產(chǎn)低成本的重要工藝手段有培養(yǎng)基的改進(jìn)和補(bǔ)料等生產(chǎn)條件的優(yōu)化，近年來(lái)過(guò)程參數(shù)監(jiān)測(cè)也成為提高發(fā)酵產(chǎn)率的有效方式，并得到越來(lái)越多的應(yīng)用。NIRS用于發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的監(jiān)測(cè)始于20世紀(jì)90年代，發(fā)酵液中的主要參數(shù)如碳源、氮源、生物量、產(chǎn)物量等均屬于NIRS可監(jiān)測(cè)的指標(biāo)范圍。按照其采樣方式可分為:off-line(離線)、at-line(近線)和 on-line(在線)［7］。

2.1 off-line

off-line是指樣本被取出并稍后分析，通常在預(yù)處理步驟之后［7］。Petersen等［8］認(rèn)為發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生物量和產(chǎn)物濃度是高度相關(guān)的，為確保模型的建立是基于分析物特定的信息，因此使用了半合成樣品，即在來(lái)自Streptomyces coelicolor發(fā)酵過(guò)程的發(fā)酵液中添加不同量的葡萄糖、銨鹽，并在采集光譜前采用0.45μm的濾膜過(guò)濾除菌體，結(jié)果表明銨鹽的預(yù)測(cè)誤差是in-situ(原位)采樣方式誤差的一半。Finn等［9］同樣采用過(guò)濾發(fā)酵液的方式對(duì)Saccharomyces cerevisiae發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，模型取得較好的預(yù)測(cè)結(jié)果，分析原因是經(jīng)過(guò)濾后，消除了生物量顆粒帶來(lái)的散射作用，因此提高了模型質(zhì)量。

off-line采樣的特點(diǎn)是樣品經(jīng)過(guò)預(yù)處理除去一些干擾，所建立模型預(yù)測(cè)誤差低、精度高，可輔助用于發(fā)酵過(guò)程中的多參數(shù)測(cè)定。但此方法無(wú)法快速監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程參數(shù)變化，因此越來(lái)越多的研究致力于at-line和on-line的采樣方式，以便更好地用于過(guò)程的在線監(jiān)測(cè)與控制。

2.2 at-line

at-line也即快速off-line分析，分析者在反應(yīng)器附近，取出樣品后即快速分析，常常在幾分鐘內(nèi)完成［7］。at-line的采樣形式所建立的模型是進(jìn)一步在線應(yīng)用的基礎(chǔ)，Arnold等［10］等確定了Escherichia coli生物量的吸收波段為2 050～2 350 nm。Finn等［9］采取at-line的形式對(duì)生物量和產(chǎn)物質(zhì)量指標(biāo)(蛋白質(zhì)比例)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果可給出近實(shí)時(shí)信息，用于確定發(fā)酵終點(diǎn)并控制終產(chǎn)物質(zhì)量。Crowley等［11］用于更具挑戰(zhàn)性的重組Pichia pastoris發(fā)酵過(guò)程。此過(guò)程包括兩種碳源(甘油和甲醇)以不同的速率和頻率添加，發(fā)酵基質(zhì)復(fù)雜，建立過(guò)程中生物量、甘油、甲醇和產(chǎn)物的一系列模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NIRS可擴(kuò)展應(yīng)用于高細(xì)胞密度并伴有明顯黏度變化的生物過(guò)程中。

at-line采樣方式所取樣品無(wú)需預(yù)處理，相比較于off-line能更快檢測(cè)出發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)。通常在幾分鐘內(nèi)，提供發(fā)酵過(guò)程的狀態(tài)，并且通過(guò)變量選擇確定目的分析物的有效光譜區(qū)間［12］，優(yōu)化采集條件，為進(jìn)一步NIRS的在線應(yīng)用提供參考。

2.3 on-line

on-line測(cè)量方式可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中的生物和化學(xué)變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。一般根據(jù)采樣方式不同細(xì)分成兩類:ex-situ(非原位)和in-situ。ex-situ通常包括采用流通小池或管路，或直接將反射探頭置于反應(yīng)器的玻璃外壁上;in-situ是指利用類似pH電極的探頭裝置放置于發(fā)酵罐內(nèi)［13］。

2.3.1 ex-situ ex-situ采樣方式中探頭并不直接和液體接觸，降低了對(duì)探頭的要求，是實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)的一種方式。Cavinato等［14］將采樣探頭置于反應(yīng)罐玻璃外壁上，利用短波近紅外光譜(700～1 100 nm)成功用于在線監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量的變化。厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物氣過(guò)程中，甘油的添加量在一定濃度范圍內(nèi)(5～7 g/L)能增加生物氣產(chǎn)出。Holm-Nielsen等［15］利用外部循環(huán)管路采集樣品光譜在線監(jiān)測(cè)和反饋控制甘油水平，使發(fā)酵過(guò)程始終保持在最佳狀態(tài)。Lomborg等［16］在線監(jiān)測(cè)玉米飼料厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物氣的過(guò)程，采用流通小池采集樣品光譜，預(yù)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性脂肪酸的含量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明NIRS是實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測(cè)的有效方式，且模型預(yù)測(cè)精度可滿足實(shí)際生產(chǎn)要求。

ex-situ中采樣探頭置于玻璃外側(cè)的采樣方式，發(fā)酵罐中劇烈攪拌和通氣將產(chǎn)生很大影響，而外部循環(huán)管路中則存在采樣均勻性的問(wèn)題。

2.3.2 in-situ in-situ采樣方式是指將分析裝置插入發(fā)酵液中。對(duì)所用探頭有很高要求，首先，探頭外殼必須承受滅菌時(shí)的壓力和溫度;其次，探頭采集的光譜受生物菌體粒徑、攪拌速率、通氣速率等影響;其三，一旦采集方式(透射或反射，光程長(zhǎng)等)確定就不可改變［17］。

Arnold等［10］利用 in-situ方式對(duì) Escherichia coli發(fā)酵過(guò)程中生物量的變化進(jìn)行預(yù)測(cè)，并考察了探頭選擇0.5，1和2 mm的光程長(zhǎng)時(shí)光譜效果，最終選擇了0.5 mm光程長(zhǎng)為最佳采樣條件，且研究發(fā)現(xiàn)在線采樣所得光譜在大于2 100 nm時(shí)多為噪聲信息，因此選擇波段1 600～1 800 nm建立模型取得較好效果。Licinia等［18］利用傅里葉變換近紅外光譜儀(FT-NIR)在線用于Streptomyces clavuligerus發(fā)酵過(guò)程的多組分同時(shí)測(cè)定，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中活性藥物成分、黏度、N源、C源的含量，所得結(jié)果準(zhǔn)確度可滿足實(shí)際工業(yè)規(guī)模的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的需要。Navratil等［19］同樣采取in-situ采樣方式，并將NIRS結(jié)合電子鼻(electronic nose，EN)繪圖用于監(jiān)測(cè)Vibrio cholerae發(fā)酵過(guò)程。結(jié)果表明，所建立的生物量，葡萄糖和乙酸鹽的近紅外模型具有很低的預(yù)測(cè)誤差，而后將NIRS數(shù)據(jù)和EN數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)主成分分析處理后分別得到第一主成分組合繪制得到補(bǔ)料分批培養(yǎng)的軌跡曲線，可用于實(shí)際生產(chǎn)中預(yù)防雜菌污染、控制流加速率等。

除在線用于細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中，in-situ方式用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中關(guān)鍵參數(shù)的監(jiān)測(cè)也被證實(shí)可行［20］。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，尤其是葡萄糖，常以低濃度(1.0～3.5 g/L)存在，增加了建模困難。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)增加建模樣本數(shù)目時(shí)，相關(guān)系數(shù)相應(yīng)增加，而主因子數(shù)和校正誤差相應(yīng)降低，選擇合適的樣本數(shù)建立的模型證明利用NIRS用于細(xì)胞培養(yǎng)關(guān)鍵參數(shù)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)是可行的。

in-situ探頭的采用，是NIRS用于發(fā)酵過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的趨勢(shì)。但是，由于發(fā)酵基質(zhì)的復(fù)雜性，在大規(guī)模應(yīng)用此技術(shù)之前，仍存在一些實(shí)際問(wèn)題需要克服，如發(fā)酵過(guò)程中劇烈的條件、發(fā)酵基質(zhì)粘稠易堵塞采樣狹縫及氣泡的散射作用等。因此，如何提高模型的穩(wěn)健性、準(zhǔn)確性仍是研究重點(diǎn)。

3 問(wèn)題與展望

微生物發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程，通常氣、液、固三態(tài)并存，因此在線檢測(cè)對(duì)于整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中了解微生物的生長(zhǎng)規(guī)律和優(yōu)化生產(chǎn)過(guò)程尤為重要。而實(shí)際過(guò)程分析中，多使用離線化學(xué)分析，這些方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。自NIRS用于發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)，從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到工業(yè)規(guī)模發(fā)展迅速。它可用于所有類型的發(fā)酵過(guò)程，但發(fā)酵過(guò)程的復(fù)雜性，使得此技術(shù)的廣泛應(yīng)用仍存在許多問(wèn)題，大多數(shù)研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，用于工業(yè)規(guī)模的研究仍不足;NIRS容易受到各因素影響，如樣品溫度、轉(zhuǎn)速、通氣等。

經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，NIRS逐漸成為一種成熟的快速分析技術(shù)，被用于藥品、食品、農(nóng)產(chǎn)品等各個(gè)領(lǐng)域中?？v觀發(fā)展趨勢(shì)，NIRS作為可靠和穩(wěn)健的工具用于監(jiān)測(cè)生物過(guò)程將具有很大發(fā)展前景。

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Research progress in fermentation process with near infrared spectroscopy

ZHANG Hui1，3，LIU Ai-hua2，ZANG Heng-chang1，3，GUO Xue-ping2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Shandong Freda Biopharmaceutical Co.，Ltd.，Jinan 250101，China;3.National Glycoengineering Research Center，Jinan 250012，China)

TQ920.6

A

1005-1678(2012)05-0689-03

2012-01-15

張 惠，女，碩士研究生，制藥工程學(xué)專業(yè);臧恒昌，通信作者，教授，碩士生導(dǎo)師，Tel:0531-88382088，E-mail:zanghcw@126.com。