索南元旦

（青海省玉樹州畜牧獸醫(yī)工作站，青海玉樹815000）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus）的新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽類高度接觸性、烈性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的動物傳染病，呈世界性分布，每年全球因雞新城疫所造成的直接經(jīng)濟損失達數(shù)十億元，是危害全球養(yǎng)雞業(yè)的最重要傳染病之一［1-5］。該病也是影響我國養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一，對我國禽類產(chǎn)品的食品安全以及人類健康都存在著潛在危害［6-7］。NDV常規(guī)的病毒分離技術(shù)和分子生物學(xué)檢測方法存在周期長、操作復(fù)雜等缺點，無法滿足基層獸醫(yī)部門大批量樣品檢測的需要。NDV基因組全長15186bp，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，其中血凝素-神經(jīng)氨酸酶糖蛋白（HN）為病毒囊膜蛋白，是病毒復(fù)制必需蛋白，為病毒特異性保護性抗原，存在中和B細胞抗原表位，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，是NDV診斷試劑研究的常用蛋白［8-11］。本研究以重組HN蛋白為包被抗原，建立了一種簡單、快速、特異、敏感新城疫病毒抗體檢測方法，為基層獸醫(yī)部門新城疫病毒抗體的檢測、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查等提供一種有效的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原與血清 原核表達的新城疫病毒重組HN蛋白由青海省動物疾病中心實驗室制備并保存。H9亞型禽流感病毒（H9AIV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）、減蛋綜合征病毒（EDSV）陽性血清及NDV參考陰性、陽性血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。檢測用血清樣品由青海省動物疾病中心實驗室收集并保存。

1.1.2 主要試劑 辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗雞IgG為Sigma公司產(chǎn)品；TMB底物液購自天根生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 包被抗原 純化的新城疫病毒重組HN蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析驗證后，采用Bradford法測定蛋白濃度，置于-70℃保存。

1.2.2 NDV HN間接ELISA操作程序 將純化后的重組HN抗原用碳酸鹽緩沖液（CBS）適當(dāng)稀釋后，每孔100μL包被ELISA反應(yīng)板，置4℃過夜。次日洗滌后，加入適當(dāng)封閉液，置37℃封閉適當(dāng)時間。洗滌后，加入適當(dāng)稀釋后的血清樣品（一抗），置37℃作用適當(dāng)時間。洗滌后，加入適當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗雞IgG（酶標(biāo)二抗），置37℃作用適當(dāng)時間。洗滌后，每孔加入100μL TMB底物顯色液，置37℃作用適當(dāng)時間。加入2mol／L H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定每孔的吸收值（OD450nm值）。

1.2.3 NDV HN間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.3.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 采用方陣滴定法，將不同濃度（51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4μg／mL）重組的 HN蛋白與不同稀釋度（1∶50、1∶100、1∶200、1∶400）的一抗組成方陣，保持其他反應(yīng)條件不變，確定最適合的抗原最佳包被濃度和一抗最佳稀釋度。

1.2.3.2 酶標(biāo)抗體最佳稀釋度與最佳作用時間的確定 采用方陣滴定法，將不同稀釋度（1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000）的 HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG 與酶標(biāo)抗體不同作用時間（30、60、90、120 min）組成方陣，保持其他反應(yīng)條件不變，確定最佳的酶標(biāo)抗體稀釋度和作用時間。

1.2.3.3 最佳封閉液與最佳封閉時間的確定 采用方陣滴定法，將不同封閉液（50g／L脫脂奶粉、10 mL／L BSA、100mL／L小牛血清、PBST）與不同封閉時間（30、60、90、120min）組成方陣，保持其他反應(yīng)條件不變，確定最佳封閉液與封閉時間。

1.2.3.4 一抗最佳作用時間的確定 一抗分別作用30、60、90、120min，保持其他反應(yīng)條件不變，確定最佳的一抗作用時間。

1.2.3.5 TMB底物最佳作用時間的確定 TMB底物分別作用5、10、15、20min，保持其他反應(yīng)條件不變，確定最佳的底物作用時間。

1.2.4 NDV HN間接ELISA判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

利用NDV HN間接ELISA已確定的最佳反應(yīng)條件檢測48份NDV陰性血清樣品，計算48份樣品的OD450nm平均值（ˉX）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），將ˉX＋3SD設(shè)為臨界值。即樣本OD450nm≥ˉX＋3SD判為陽性，樣本OD450nm＜ˉX＋2SD判為陰性，當(dāng)ˉX＋2SD≤樣本OD450nm＜ˉX＋3SD判為可疑。

1.2.5 交叉反應(yīng)試驗 用已建立的NDV HN間接ELISA檢測 AIV（H9亞型）、IBV、IBDV、EDSV 陽性血清，同時設(shè)NDV陽性血清和陰性血清對照，確定檢測方法的特異性。

1.2.6 靈敏度檢測 將NDV陽性血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶1 2800、1∶25 600稀釋，用已建立的NDV HN間接ELISA檢測，確定檢測方法的敏感性。

1.2.7 重復(fù)性試驗

1.2.7.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗 選取NDV陽性血清樣品和陰性血清樣品各3份，在相同時間用同一塊ELISA反應(yīng)板檢測，每份血清樣品做6個重復(fù)，統(tǒng)計變異系數(shù)。

1.2.7.2 批間重復(fù)性試驗 選取NDV陽性血清樣品和陰性血清樣品各3份，在4個不同時間分別用4塊ELISA反應(yīng)板檢測，統(tǒng)計變異系數(shù)。

1.2.8 臨床應(yīng)用 應(yīng)用已建立的NDV HN間接ELISA和血凝抑制試驗（HI）同時檢測采集于各地的568份血清樣品，統(tǒng)計血清抗體陽性率，同時統(tǒng)計NDV HN間接ELISA方法相對于HI的特異性、敏感性及符合率。

2 結(jié)果

2.1 診斷抗原的制備

純化的重組HN蛋白（圖1）經(jīng)Bradford法測定濃度為0.512mg／mL。

圖1 HN純化蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified HN protein

2.2 NDV HN間接ELISA最佳反應(yīng)條件的確定

經(jīng)優(yōu)化，重組抗原最佳工作濃度為3.2μg／mL，血清最佳稀釋度為1∶100；酶標(biāo)抗體最佳稀釋度為1∶4 000，最佳作用時間為60min；最佳封閉液為10 mL／L BSA，最佳封閉時間為60min；一抗最佳作用時間為60min；TMB底物最佳作用時間為15min。

2.3 NDV HN間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

NDV HN間接ELISA檢測48份NDV陰性血清樣本的OD450nm平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.202與0.061。計算出NDV HN間接ELISA的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：樣本OD450nm≥0.385為陽性；樣本OD450 nm＜0.324為陰性；0.324≤樣本OD450nm＜0.385為可疑，對可疑樣本須重新檢測。

2.4 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果

如表1所示，NDV HN間接ELISA檢測AIV（H9亞型）、IBV、IBDV、EDSV 陽性血清的 OD450 nm值均低于0.324，不發(fā)生交叉反應(yīng)，表明建立的檢測方法具有較好的特異性。

2.5 靈敏度檢測試驗結(jié)果

如圖2所示，NDV HN間接ELISA檢測NDV陽性血清的最低稀釋度為1∶12 800（OD450nm=0.401），表明建立的檢測方法具有較好的敏感性。

2.6 重復(fù)性試驗結(jié)果

批內(nèi)重復(fù)性試驗的變異系數(shù)集中在3.24%～4.55%之間（表2）；批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)集中在4.12%～8.22%之間（表3）。表明建立的檢測方法具有較好的重復(fù)性。

表1 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果Table 1 Result of cross-reaction

圖2 NDV HN間接ELISA靈敏度檢測Fig.2 Sensitivity test of NDV HN indirect ELISA

2.7 臨床應(yīng)用檢測結(jié)果

568份血清樣品，用NDV HN間接ELISA檢測出陽性樣品466份，陽性率為82.0%；HI檢測出陽性樣品458份，陽性率為80.6%。HI檢測為陽性的458份血清樣品，用NDV HN間接ELISA檢測，陽性451份，陰性7份，NDV HN間接ELISA相對于HI的敏感性為98.5%（451／458）；HI檢測陰性的110份血清樣品，NDV HN間接ELISA檢測出陰性95份，陽性15份，NDV HN間接ELISA相對于HI的特異性為86.4%（95／110）；HN間接ELISA相對于 HI的總符合率為96.1%（546／568）。

表2 批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 Intro-batch repetition test

表3 批間重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Inter-batch repetition test

3 討論

目前，對于新城疫病毒的診斷主要以病毒的分離鑒定和分子生物學(xué)方法等病原學(xué)檢測手段為主，病原學(xué)檢測方法雖然準(zhǔn)確，但試驗周期長、操作復(fù)雜、不適合大批量樣品檢測。血清學(xué)等抗體檢測方法雖然目前不能有效區(qū)分自然感染抗體和疫苗免疫抗體，但由于血清樣品采集方便、容易保存和高通量檢測等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，且在知道流行病學(xué)的前提下，證實其抗體陽性就已經(jīng)具有了診斷意義。目前新城疫的抗體檢測主要以血凝抑制試驗（HI）為主，HI雖然操作簡單、但存在敏感性較低，血清的質(zhì)量對檢測結(jié)果影響較大，肉眼判讀、誤差大等缺點，不適合基層獸醫(yī)工作者廣泛使用。隨著酶免疫技術(shù)的發(fā)展，ELISA逐步應(yīng)用于新城疫病毒的抗體檢測，Snyder D B等［12］利用純化的新城疫全病毒作為包被抗原，建立了檢測新城疫抗體的間接ELISA方法。Thayer S G等［13］通過比較間接 ELISA、HI、AGP三種新城疫病毒抗體檢測方法，得出間接ELISA方法具有微量、敏感、特異、高通量的優(yōu)點，將在新城疫抗體的檢測上具有廣闊的應(yīng)用前景。張國中等［14］分別采用間接ELISA和HI兩種方法對臨床上收集的152份HI滴度不同的血清樣品和ND的標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清進行了新城疫病毒抗體檢測，并分析了間接ELISA和HI兩種方法的相關(guān)性，得出間接ELISA快速、高通量、敏感、特異，較HI更適合于新城疫抗體的檢測和流行病學(xué)調(diào)查。但以往的間接ELISA多以全病毒作為包被抗原，全病毒由于受病毒培養(yǎng)與純化方面的限制，存在特異性低、成本高、容易散毒等缺點，而HN蛋白為NDV主要的免疫原蛋白，檢測抗HN蛋白抗體水平與檢測抗全病毒抗體水平存在一致性。劉鈾等［11］用T4噬菌體表達的重組新城疫病毒HN蛋白為包被抗原，建立了檢測新城疫抗體的間接ELISA方法，該方法檢測靈敏度明顯高于HI和AGP試驗，但該研究未進行靈敏度的標(biāo)定，也沒有進行臨床樣品的應(yīng)用檢測，沒有對該檢測方法進行應(yīng)用評價。本研究以原核表達的NDV HN重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測NDV HN抗體的間接ELISA診斷方法，該檢測方法顯示出了較好的特異性、敏感性、重復(fù)性和適用性，將具有良好的使用前景。本實驗室將進一步進行間接ELISA試劑盒穩(wěn)定劑的研究工作，以便盡早將該檢測方法組裝成診斷試劑盒，為NDV抗體檢測、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡便、敏感、快速、特異的血清學(xué)診斷試劑盒。

［1］ Mohamed M H，Kumar S，Paldurai A，et al.Sequence analysis of fusion protein gene of Newcastle disease virus isolated from outbreaks in Egypt during 2006［J］.Virol J，2011，8：237.

［2］ Dortmans J C，Koch G，Rottier P J，et al.Virulence of newcastle disease virus：what is known so far［J］.Vet Res，2011，42（1）：122.

［3］ Choi KS，Lee E K，Jeon W J，et al.Molecular epidemiologic investigation of lentogenic Newcastle disease virus from do-mestic birds at live bird markets in Korea［J］.Avian Dis，2012，56（1）：218-223.

［4］ Bogoyavlenskiy A，Berezin V，Prilipov A，et al.Characterization of pigeon paramyxoviruses（Newcastle disease virus）isolated in Kazakhstan in 2005［J］.Virol Sin，2012，27（2）：93-99.

［5］ Yuan X，Wang Y，Yang J，et al.Genetic and biological characterizations of a Newcastle disease virus from swine in China［J］.Virol J，2012，9（1）：129.

［6］ 楊少華，胡北俠，許傳田，等.三株新城疫病毒強毒株的生物學(xué)特性及全基因組序列分析［J］.病毒學(xué)報，2012，10（2）：51-58.

［7］ 金仕強，孟春春，仇旭升，等.Class I新城疫病毒概述［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2012，33（4）：102-105.

［8］ 鄒海濤，蘭鄒然，姜 平.新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白功能及檢測技術(shù)研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2012，33（4）：85-89.

［9］ 張立娜，賈競波.不同基因型新城疫病毒HN基因保守區(qū)域的克隆表達及免疫活性的比較［J］.中國生物工程雜志，2008，28（5）：93-98.

［10］ 趙 坤，李任峰，趙 樸，等.新城疫病毒單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，45（4）：428-431.

［11］ 劉 鈾，畢英佐，曹永長.用重組HN蛋白建立新城疫抗體檢測的ELISA方法［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，27（4）：509-511.

［12］ Snyder D B，Marquardt W W，Mallinson E T，et al.Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay.I.Measurement of antibody activity titer against Newcastle disease virus in a single serum dilution［J］.Avian Dis，1983，27（1）：161-170.

［13］ Thayer S G，Villegas P，F(xiàn)letcher O J.Comparison of two commercial enzyme-linked immunosorbent assays and conventional methods for avian serology［J］，Avian Dis，1987，31（1）：120-124.

［14］ 張國中，胡旭東，秦春芝，等.間接ELISA和HI方法檢測雞新城疫病毒抗體的相關(guān)性分析［J］.中國家禽，2007，29（4）：14-17.