耿 崗

（青海省海西州烏蘭縣畜牧獸醫(yī)工作站，青海烏蘭817100）

新城疫病毒屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）中的禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），是一種不分節(jié)段的單鏈、負鏈RNA病毒［1-2］。由NDV引起的新城疫（Newcastle disease，ND）是一種多病型的高度接觸性、急性、烈性傳染病，可感染火雞、家禽以及野禽類，具有傳播速度快、發(fā)病率高、病死率高等特征，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)引起了4次大流行，給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失［3-8］。該病也是困擾我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病，幾十年來一直是我國養(yǎng)禽業(yè)堅持預(yù)防免疫控制的主要傳染病之一［9-11］。該病的存在嚴重制約著我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，同時對我國禽類產(chǎn)品的出口、食品安全以及人類健康都存在著潛在的危害［11］。因此，加強NDV診斷技術(shù)的研究，對預(yù)防和控制本病以及人類健康都具有十分重要的現(xiàn)實意義。NDV常規(guī)的病毒分離技術(shù)和免疫血清學(xué)檢測方法存在操作復(fù)雜、費時費力、檢測周期較長等缺點，不能滿足快速、準確診斷的需要。鑒于此，本研究建立了一種敏感、特異、準確、簡單、快速的一步法RT-PCR方法，為ND的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種有效的檢測技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）均由青海省動物疾病中心實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、Trizol為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)已發(fā)表的NDV基因組序列，利用生物學(xué)軟件設(shè)計合成一對引物，NDVP1：5′-GGCCGCAGCTCTGATACAA-3′； NDVP2：5′-TACATACAGGCCGACGTATT-3′，將 引物序列送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2.2 病毒的增殖 將NDV經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，收集120h雞胚尿囊液，于4℃以10 000 r／min離心15min，取上清，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒基因組RNA的提取 取上述的NDV病毒液200μL，加Trizol試劑600μL，按照Trizol試劑的使用說明提取NDV基因組RNA，紫外分光光度計測定含量。

1.2.4 RT-PCR擴增反應(yīng) 根據(jù)一步法RT-PCR檢測試劑盒說明書確定RT-PCR反應(yīng)體系為：25 μL 2×1step buffer，2μL Prime Script 1step enzyme mix，上 下 游 引 物 NDVP1、NDVP2 （20 μmol／μL）適量，模板 RNA 適量，加水至50μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃45min；94℃3min；94℃45s，適宜溫度45s，72℃45s，30個循環(huán)；72℃10min，4℃終止反應(yīng)。

1.2.5 RT-PCR擴增反應(yīng)優(yōu)化

1.2.5.1 最適模板含量的確定 測定提取的病毒基因組RNA濃度后，適當稀釋，使其分別含RNA 10μg、1μg、0.1μg、10ng、1ng、0.1ng，分別以RNA為模板，保持其他反應(yīng)條件不變，進行RTPCR擴增，確定最佳模板含量。

1.2.5.2 最適引物含量的確定 在RT-PCR反應(yīng)體系中分別加入上下游引物（20μmol／L）0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1μL，其他反應(yīng)條件不變，進行 RTPCR擴增，確定最佳引物含量。

1.2.5.3 最適退火溫度的確定 RT-PCR反應(yīng)的退火溫度分別設(shè)50、52、54、56、58℃，進行 RT-PCR擴增，確定最佳退火溫度。

1.2.6 RT-PCR擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定 取擴增產(chǎn)物5μL，在10g／L的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)掃描進行初步分析鑒定。然后用膠回收試劑盒回收目的片段，與pMD18-T克隆載體于4℃過夜連接，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取生長的單菌落過夜培養(yǎng)增菌，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ／HindⅢ雙酶切鑒定后得到陽性克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。

1.2.7 RT-PCR敏感性試驗 提取NDV RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當于含有10μg、1μg、0.1μg、10ng、1ng、0.1ng RNA，以稀釋的RNA為模板分別進行RT-PCR擴增，確定該檢測方法的敏感性。

1.2.8 RT-PCR交叉反應(yīng)試驗 分別提取新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的RNA或DNA，用已建立的方法進行擴增，確定建立的檢測方法的特異性。

1.2.9 RT-PCR重復(fù)性試驗 用建立的RT-PCR檢測方法，對新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性法氏囊病病毒（IBDV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、3份NDV陽性樣品、3份NDV陰性樣品重復(fù)檢測3次，確定本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.10 RT-PCR方法的臨床應(yīng)用 取現(xiàn)地送檢的雞肝、脾、氣管等組織病料樣品共計68份，用建立的一步法RT-PCR方法進行檢測，對檢測結(jié)果為陽性和陰性的部分樣品進行病毒分離鑒定，比較該RTPCR方法相對于病毒分離鑒定的符合率。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增反應(yīng)的確定

根據(jù)試驗確定最適模板含量為0.1μg，最適引物含量為10μmol，最適退火溫度為54℃。確定RT-PCR反應(yīng)體系為：25μL 2×1step buffer，2μL prime script 1step enzyme Mix，上下游引物NDVP1、NDVP2（20μmol／μL）各0.5μL，5μL RNA，加水至50μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃45min；94℃3min；94℃45s，54℃45s，72℃45s，30個循環(huán)；72℃10min，4℃終止反應(yīng)。

2.2 RT-PCR擴增產(chǎn)物的檢測

RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳，顯示在約705bp處可見一個特異性條帶，與預(yù)期的大小相符（圖1）。

2.3 RT-PCR擴增產(chǎn)物的序列鑒定

RT-PCR擴增產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上，用EcoRⅠ／HindⅢ進行雙酶切鑒定（圖2）。將雙酶切鑒定正確的克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序表明，插入到T載體上的基因片段與NDV La Sota株的核苷酸序列一致。

圖1 RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 Result of RT-PCR amplification

圖2 RT-PCR產(chǎn)物的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of RT-PCR products by enzyme digestion

2.4 敏感性試驗結(jié)果

不同模板含量的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析（圖3），可以看出RT-PCR檢測的靈敏度可以達到1ng RNA。

2.5 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果

用該一步法RT-PCR方法僅對NDV擴增出了705bp的特異性基因片段，而對IBV、IBDV、ILTV均未擴增出基因片段（圖4）。說明該檢測方法具有較高的特異性。

2.6 重復(fù)性試驗結(jié)果

經(jīng)過3次重復(fù)檢測，試驗結(jié)果完全一致，說明該一步RT-PCR方法顯示出了較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性（圖5）。

圖3 敏感性試驗結(jié)果Fig.3 Sensitivity test result

圖4 特異性試驗結(jié)果Fig.4 Specificity test result

圖5 一次重復(fù)性試驗結(jié)果Fig.5 One reproducibility test result

2.7 RT-PCR方法的臨床應(yīng)用結(jié)果

用本研究建立的一步法RT-PCR方法檢測了現(xiàn)地送檢的雞肝、脾、氣管等組織病料樣品共計68份，檢出陽性樣品53份，陽性率77.9%。選取RTPCR檢測的10份陽性樣品和10份陰性樣品，進行病毒的分離鑒定，結(jié)果10份陽性樣品中有9份成功分離到NDV，10份陰性樣品中均沒有分離到NDV。表明該RT-PCR方法相對于病毒分離鑒定的符合率為95%（19／20），具有較好的臨床應(yīng)用適用性。

3 討論

典型的新城疫根據(jù)臨床癥狀、病理變化、流行病學(xué)等資料可做出診斷。但目前新城疫的流行發(fā)生了變化，常常出現(xiàn)非典型新城疫，因非典型新城疫臨床癥狀和病理變化不明顯，呈現(xiàn)出非急性致病性，根據(jù)臨床資料常常難以做出準確診斷，需要采用實驗室方法進行確診［12］。而且目前包括我國在內(nèi)的多數(shù)國家普遍使用新城疫病毒活疫苗，家禽中往往有緩發(fā)型NDV毒株存在，給新城疫的診斷又增加了難度［12］。病毒分離鑒定是新城疫最經(jīng)典、最權(quán)威的病原檢測方法，但所需檢測時間較長，且對感染潛伏期尚未出現(xiàn)臨床癥狀的機體檢測不出體內(nèi)的NDV。RT-PCR技術(shù)可以檢測樣本中特定病原體的核酸序列，且能夠檢測處于潛伏期的機體中的NDV，具有常規(guī)檢測方法無法比擬的優(yōu)勢，為NDV的早期檢測提供了一種科學(xué)的模式和方法。早在2008年，溫貴蘭等［13］就利用RT-PCR方法鑒定分離的新城疫病毒，并應(yīng)用該方法的3對新城疫特異性鑒定引物對自然發(fā)病雞的腦、脾、咽喉試子、泄殖腔試子等組織病料進行新城疫病毒檢測，其檢測結(jié)果和傳統(tǒng)病毒分離與毒力鑒定的結(jié)果相一致。魏潤生等［14］建立了針對雞傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒和禽流感病毒的多重RT-PCR鑒別診斷方法，可用于NDV與雞傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒的快速鑒別診斷，但操作較復(fù)雜。郭浩等［15］用雙抗夾心ELISA法、懸液芯片系統(tǒng)、RT-PCR 3種方法對新城疫病毒進行了檢測，并比較了這3種檢測方法的優(yōu)缺點，得出PR-PCR檢測方法雖然所需試劑、儀器設(shè)備較昂貴，但其在核酸水平上對病毒進行檢測，靈敏度較高，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究在總結(jié)前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)NDV保守區(qū)序列設(shè)計一對特異性引物，建立了檢測NDV的一步RTPCR方法。該RT-PCR方法使用一步法RT-PCR檢測試劑盒，使操作更簡單、檢測更快速、耗時更少，整個檢測過程在3h內(nèi)即可完成?？傊?，本研究建立的NDV一步法RT-PCR方法敏感、特異、準確、簡單、快速，適用于ND的早期快速診斷，將為ND的臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡單、快速的分子生物學(xué)診斷方法，對有效預(yù)防控制ND具有重要意義。

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